Summary
Мы представляем метод хроматин иммунопреципитации из спинных ганглиев ткани корневой следующие аксонального травмы. Подход может быть использован для определения конкретных сайтов связывания транскрипционных факторов и эпигенетические модификации гистонов и ДНК важны для регенерации аксонов ранения в обоих периферической и центральной нервной системы.
Abstract
Аксоны в центральной нервной системе (ЦНС) не восстанавливаются в то время как в периферической нервной системы (ПНС) не регенерировать в ограниченном объеме после травмы (Дэн и соавт., 2006). Следует признать, что транскрипционный программы необходимы для аксонов и аксонального результатом активизируются после травмы в ПНС (Makwana и соавт., 2005). Однако инструменты, доступные для анализа нейронной регуляции генов в естественных условиях ограничено и часто сложной задачей.
Спинных ганглиев корня (DRG) предлагают отличные модели системы травм, так как ЦНС и ПНС иннервируются раздвоенный аксон происходящей из той же сомы. Ганглии представляют собой дискретные коллекция клеточных тел, где все транскрипционные события происходят, и тем самым обеспечить четкое определение области транскрипционной активности, которые можно легко и воспроизводимо удалены от животного. Повреждение нервных волокон в ПНС (например, седалищного нерва), где аксонального регенерация происходит, должно выявить набор транскрипционных программы, отличные от тех, отвечая на аналогичный травмы в ЦНС, где регенерации не происходит (например, спинного мозга ). Участки для связывания транскрипционных факторов, гистонов и ДНК модификации в результате несчастного случая либо ПНС или ЦНС могут быть охарактеризованы с помощью хроматин иммунопреципитации (чип).
Здесь мы описываем ChIP протокол с использованием фиксированных тканей DRG мыши следующий аксонального травмы. Это мощное сочетание обеспечивает средства для характеристики про-хроматина регенерации среды, необходимой для продвижения аксонального регенерации.
Protocol
1. Седалищный и спинной травмы колонке нерва
- Животное помещают на хирургическое полотенце и под ним thermopad присутствует на протяжении всей процедуры поддержания температуры тела мыши при 37 ° C. Все животные под наркозом для операции с непрерывным изофлуран / O 2 администрации. Хирургические инструменты автоклаве перед процедурой.
- Для седалищного травмы, оба задних тщательно побрился, и депиляция комплектуется общим для удаления волос до чистки кожи спиртом следует Betadyne 3 раза.
- Седалищный нерв подвергается, сделав 4 мм разрез задней и параллельно бедренной кости на середине бедра через кожу и путем распространения мышцы обособленно двуглавой мышцы бедра с мелкими щипцами.
- Подвергается седалищного нерва, то травмирован, а кожа закрыта с двумя клипами шва.
ПРИМЕЧАНИЕ: тот же разрез делается, чтобы разоблачить седалищного нерва, но рана зашивается закрыты оставляя нетронутыми нервы за вред, обман.
- Для спинных травм колонка, спинка мыши тщательно побрился, и депиляция комплектуется общим для удаления волос до чистки кожи спиртом спрей / салфетки.
- Спинной мозг подвергается делая 2,5 см разрез с примерно T7 с T13. Кожа раздвинуты, и соединительную ткань, удаляется вместе с позвонком T9 на T11.
- Ламинэктомия выполняется на уровне T10
Примечание: Для большинства экспериментов, ламинэктомия считается травмы Шам.
- Несколько капель Xylocain добавляются в ткани анестезировать мозга и мозговой оболочки удаляется, обращая внимание не трогать спинного мозга.
- Спинной колонки ранения и мышцы зашивается близко, снова обращая внимание не трогать спинного мозга. Наконец, кожа зашивается закрыта с шовным клипов. Бупренорфин (0,1 мг / кг массы тела) следует назначать два раза в день в течение 48 часов или пока не нужны.
2. Перекрестное связывание
- Рассеките L4 и L5 DRG из поврежденных мышей после euthanization. Сбор общей сложности 16 DRG в ледяную HBSS + ингибиторы протеазы коктейль (2 ранены и 2 фиктивный DRG от каждого животного в общей сложности 4 животных).
- Кратко центрифуги DRG, затем осторожно удалите HBSS и добавить 500 мкл 1% формальдегида в PBS + коктейль ингибиторов протеаз и инкубировать образца в течение 30 минут при температуре 37 ° C.
Важным шагом. Используйте свежие, молекулярной биологии формальдегида класса.
- Добавить 125 мМ глицина, чтобы остановить фиксации и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
- Кратко центрифуги, аспирата с буфером, и мыть ткани в два раза с 500 мкл ледяной PBS + коктейль ингибиторов протеаз.
3. Подготовка ядра и хроматина стрижки
- Аспирацию с PBS, добавить 400 мкл буфера для лизиса SDS, трансфер в предварительно охлажденной микроцентрифужных трубки, и нарушить ткань с примерно 30 ударов с micropestle.
Важный шаг. Лизис и нарушение ткани являются жизненно важными для хорошего урожая сшитый хроматина.
- Разрушать ультразвуком образца с 8 импульсов, 10 секунд каждый при 70% мощности (Bandelin, Sonoplus GM70).
ВНИМАНИЕ. Стрижка хроматина должна быть оптимизирована для вашего конкретного ультразвуком настройки и надлежащего фрагментации хроматина, должны быть проверены перед запуском реальном эксперименте IP (см. раздел 3).
ПРИМЕЧАНИЕ. Фрагментации хроматина, также может быть выполнена микрококковой нуклеазы (MNase) пищеварение. Как правило, фрагментации с помощью ультразвука является предпочтительным для фиксированных тканей, в то время MNase пищеварение благоприятствования для отечественных иммунопреципитации хроматина ткани. Сшитые, стриженого хроматина могут храниться при температуре -80 ° С в течение 2 месяцев, но избежать повторных циклов замораживания / оттаивания.
4. Анализ хроматина пищеварения (рекомендуется)
- Удалить 10 мкл ваш стриженой хроматина пробы для анализа. Добавьте 200 мМ NaCl в образец и обратного сшивки путем инкубации при температуре 65 ° С в течение 2 часов.
- Purify ДНК (см. раздел 8) и запустить 1% агарозном геле. ДНК должны быть фрагментированы на длину приблизительно 200-1000 п.о. (рис. 1).
ВНИМАНИЕ. Чрезмерной фрагментации хроматина может привести к снижению сигнала, в то время как неполное фрагментация приведет к снижению разрешения и более фоне.
5. Иммунопреципитация
- Определить количество иммунопреципитации реакций (см. примечание ниже), и разделить поровну на образцы новых труб. Довести объем каждойдо 500 мкл буфера с чипом + коктейль ингибиторов протеаз.
- Удалить 5 мкл разведенного образца вашей и передачи в новую трубу. Это ваш 1% входного образца и она будет храниться при температуре -20 ° С до необходимости (раздел 7).
- Для каждого иммунопреципитации, добавить соответствующие антитела или нормального контроля IgG и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи с вращением.
ПРИМЕЧАНИЕ. При определении числа иммунопреципитации, положительного контроля (например, гистонов антитело, Н3) и отрицательный контроль (нормальный IgG) должны быть рассмотрены. Количество антител, используемых для каждого IP колеблется от антител и должны быть определены эмпирически. Однако, как правило, в пределах 2-10 мкг / иммунопреципитации.
- Чтобы ваш иммунопреципитации антитело / белок / ДНК комплекс, добавить 30 мкл ChIP класса Protein G Магнитные гранулы и инкубировать в течение 2 ч при 4 ° С с вращением.
6. Мытье
- Для выпадающего связаны хроматин-бусинка комплекс, место трубки на магнитной стойке. Подождите, пока раствор не станет прозрачным, а затем осторожно удалите супернатант.
- Добавить 1 мл низкой вымыть соль (ChIP буфера) бусы и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 3-5 минут с вращением, то выпадающие бисером и аспирации от мытья, как в пункте 6.1. Повторите этот шаг для общей сложности 3 стирок.
- Добавить 1 мл промывочного буфера высокой соли (ChIP буфера + 350 мМ NaCl) на бусы и инкубировать в течение 3-5 минут с вращением, то выпадающие бисером и аспирации от мытья, как в пункте 6.1.
7. Элюирование и обратная сшивка
- Возьмите образцы входных из -20 ° С, добавить 150 мкл буфера ChIP элюции и отложите в сторону при комнатной температуре до Шаг 7.5.
- Добавить 150 мкл буфера 1x Элюирование чип для каждого IP-образец с шага 6.3.
- Место труб в thermomixer и элюировать хроматина из бисера путем инкубации образцов при 65 ° С в течение 30 минут с нежным вортексе.
- Раскрывающееся бусины на магнитной стойке, и тщательно передачи элюировали хроматина (супернатант) в новые трубы.
- Для всех труб, в том числе ваши образцы входных, добавить 200 мМ хлорида натрия и 40 мкг / реакции протеиназы К и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 2 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Элюирования шага могут быть выполнены при комнатной температуре, тоже, но это может быть не столь эффективным.
8. ДНК восстановления
- Добавьте 1 объемом фенол / хлороформ вашим образцам с шага 7.5 и вихрь в течение 30 секунд.
- Центрифуга с максимальной скоростью в микроцентрифужных при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Тщательно восстановить водный (верхний) фазы в новых трубах, добавить 1 объемом хлороформа в водной фазе, а вихрь в течение 30 секунд.
- Центрифуга с максимальной скоростью в микроцентрифужных при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Тщательно восстановить водный (верхний) фазы в новых трубах, затем добавить 300 мм NaOAc, 20 мкг / реакции гликогена, и 2,5 объемов ледяной 100% этанола.
ВНИМАНИЕ. Добавлением перевозчика, такие как гликоген, необходимо для повышения осадков относительно небольших размеров фрагментов ДНК.
- Инкубируйте при -80 ° С в течение 2 часов для осаждения ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ. Осадков шаг также может быть выполнена в течение ночи при температуре -20 ° С.
- Центрифуга образцов при максимальной скорости в микроцентрифужных в течение 20 минут при 4 ° C.
- Осторожно удалите супернатант и мыть осажденный гранулы ДНК с 300 мкл ледяной 70% этанола.
- Центрифуга образцов при максимальной скорости в микроцентрифужных в течение 10 минут при 4 ° C.
- Осторожно удалите столько супернатант это возможно, и пусть гранулы воздушно-сухой.
- Ресуспендируют в 20 мкл стерильной H 2 O. Образцы теперь готовы для ПЦР или ДНК можно хранить при температуре -20 ° C.
9. Представитель Результаты
Представитель результате ChIP эксперимент в ДРГ следующие седалищного поражения показано (рис. 1 и 2). Во-первых, мы показываем фрагментированной ДНК длиной около 200-1000 п.о. (рис. 1). Во-вторых, мы демонстрируем сигнал ПЦР следующий чип от проксимальных промоутер рост связан белок-43 (GAP-43) только после травмы седалищного нерва (переулок 4, рис. 2, 5 '). Нет сигнала ПЦР имеет место, когда животное получает травму фиктивный только (дорожка 3), а при использовании обычного IgG сыворотки для IP (дорожка 5 и 6). Для проверки специфичности антител, мы проанализировали те же образцы ДНК, но используется набор элементов управления грунтовка, которая обнаруживает региона в 3'-UTR нашей интересующего гена, где нет занятости не ожидается. ПЦР сигналы отсутствуют во всех полос (полосы 3-6, рис. 2, 3 '), за исключением входного сигнала, представляющих Стороны, IP образцы ДНК в стандартной ПЦР управления (полоса 1-2, FIGUповторно 2). Этот чип процедура может быть выполнена следующим либо седалищного или спинальной травме спинного колонки, которые обобщены в схеме (рис. 3).
Рисунок 1. Агарозном геле обратной сшитого ДНК, который был стриженый с помощью ультразвука в необходимом диапазоне длин фрагментов.
Рисунок 2. Полу-количественный ПЦР результаты DRG ткани следующие седалищного нерва поражение, показывающие, что ацетилированного p53 связывается с GAP-43 проксимальной области промотора 48 часов после повреждения седалищного нерва. Управление ПЦР из той же ткани показывают, что DRG ацетилированного р53 не связывается с контрольной области ДНК, расположенная в 3'-нетранслируемой области (УТР) от GAP-43 гена (S = Шам, I = раненых).
Рисунок 3. Общую диаграмму, показывающую расположение поражения сайтов на седалищный нерв и спинной колонки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает метод прямо спросить о хроматина окружающую среду во время аксонального регенерации нервной системы взрослого следующие аксонального травмы. Она включает в себя модели DRG травмы с хроматином иммунопреципитации для исследования транскрипции и эпигенетических среду после травмы либо ПНС и ЦНС. Это особенно полезно для исследователей, которые хотели бы, чтобы охарактеризовать предполагаемые сайты связывания для своих любимых фактор транскрипции, а также определить, является ли размещение из этих сайтов происходит в ответ на травму. Эпигенетическая модификации гистонов и ДНК в этих участках могут быть одновременно контролировать. Аналогичный протокол могут быть выполнены следующие лица поражения нерва, где лицевой нерв ядер можно разрезать из ствола мозга и обрабатываются ChIP как сообщалось ранее (Тедески и соавт., 2009).
В качестве типичных для анализов хроматин иммунопреципитации, два важнейших шагов в протоколе, (1) эффективное фрагментации и растворение ДНК-белкового комплекса, и (2) наличие хорошей антител иммунопреципитации для белок. Одно из ограничений, которые могли бы путать эти два шага, является низкий уровень исходного материала. По сравнению с другими структурами, такими как головного или спинного мозга, DRG обеспечивают сравнительно небольшое количество ткани. Кроме того, DRG состоит из смеси населения нейронов, а также глиальные клетки, которые могут иметь различные среды хроматина. Это может привести к гетерогенным сигналов IP, однако это предостережение присутствует в большинстве образцов, взятых у нервной системы. Потенциальное решение является выполнение ChIP после флуоресцентные активированный сортировки клеток из transgenically флуоресцентно меченных DRG нейроны, (см., например YFP-H мышей, Богдан и соавт., 2004), или иммуно-изоляции нейронов с помощью магнитных шариков (Lee и соавт. , 2005). Тем не менее, эти два подхода должны быть проверены на чип в ДРГ и, вероятно, потребуется увеличение количества исходного материала.
Мы успешно использовали этот метод для идентификации сайтов связывания нескольких факторов транскрипции и коактиваторы на промоутера известных регенерации связанные гены, и мы должны использовать как полуколичественного и количественного ПЦР-методов по обнаружению иммунопреципитации ДНК. Одно будущее дополнение к этому протоколу может быть использование черепичных микрочипов следующие ChIP (CHIP-на-чипе), а средства для выявления окончательного сигнала ДНК. ChIP-на-чипе позволит значительно увеличить количество выявленных транскрипции сайтов через высокую пропускную способность беспристрастного подхода. Это также может позволить изучение того, как два или более фактора транскрипции могут совместно взаимодействовать на уровне генома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Андреа Тедески за помощью в установлении первоначальных экспериментов чип в лабораторных и Рикко Lindner за вклад для тонкой настройки условий для чип. Эта работа была поддержана фондом Херти; Фортуна Грант, Университет Тюбингена, и DFG DI 1497/1-1 грантов (все предоставляемые Симоне ди Джованни).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
