Summary
Biz dorsal kök ganglion dokusundan kromatin immunoprecipitation aksonal yaralanma sonrası için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşım, belirli bir transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri ve periferik ve santral sinir sistemi hem de yaralı aksonların rejenerasyonu için histon ve DNA önemli epigenetik modifikasyon tanımlamak için kullanılır.
Abstract
Periferik sinir sistemi (PNS), bu yaralanma sonrası sınırlı bir ölçüde (Teng ve ark, 2006), rejenerasyon yaparken, merkezi sinir sistemi (MSS) aksonlar rejenere yok . PNS (Makwana ve ark, 2005) yaralanması üzerine yeniden neurite ve aksonal akıbet transkripsiyonel programları için gerekli olduğu kabul edilmektedir. Ancak, in vivo nöronal gen regülasyonu analiz araçları sınırlı ve genellikle zorlu .
Dorsal kök gangliyon (DRG), santral sinir sistemi ve PNS hem de aynı soma kaynaklanan bir çatallı akson tarafından innerve çünkü mükemmel bir yaralanma model sistem sunmaktadır. Ganglionlar tüm transkripsiyonel olaylar meydana hücre gövdeleri ayrı bir toplama temsil eder ve bu nedenle kolay ve tekrarlanabilir hayvan çıkarılabilir transkripsiyonel aktivitesini açıkça tanımlanmış bir bölge. Aksonal rejenerasyon meydana PNS (örneğin siyatik sinir), sinir lifleri Sakatlık rejenerasyon yerde (örneğin omurilik almaz MSS benzer bir yaralanma yanıt, farklı bir dizi transkripsiyonel programları ortaya .) Histon, bağlayıcı transkripsiyon faktörü ve yaralanma ya PNS veya MSS çıkan DNA modifikasyonu Siteleri kromatin immunoprecipitation (ChIP) ile karakterize edilebilir.
Burada, aksonal yaralanma sonrasında sabit fare DRG doku kullanarak ChIP protokol açıklar. Bu güçlü kombinasyon, aksonal rejenerasyonu teşvik için gerekli yanlısı rejenerasyon kromatin ortamı tanımlamak için bir araç sağlar.
Protocol
1. Siyatik ve dorsal kolon sinir hasarı
- Hayvan cerrahi bir havlu üzerine yerleştirilir ve bunun altında bir thermopad farenin vücut ısısı 37 ° tutmak ° C işlem boyunca mevcut. Bütün hayvanlar, sürekli bir izofluran O / 2 yönetim ameliyat için anestezi . Cerrahi aletler, işlem öncesi otoklavlanırlar.
- Siyatik yaralanma, hem kıç dikkatle traş, epilasyon, Betadyne 3 kez izledi alkol ile cilt temizliği için önce genel saç çıkarıcı ile tamamlandı.
- Siyatik sinir, 4 mm'lik kesi arka ve deri yoluyla orta uyluk femur paralel yaparak ve ince forseps ile biseps femoris kasları dışında yayarak maruz kalmaktadır.
- Maruz siyatik sinir sonra yaralı ve cilt iki dikiş klipleri ile kapatılır.
NOT: Aynı kesi siyatik sinir ortaya çıkarmak için yapılır, fakat yara, sinir sahte yaralanma zedelemeden kapalı sütüre edilir .
- Dorsal kolon yaralanma, fare arkasına dikkatle traş ve epilasyon alkol sprey / okutma ile cilt temizliği için önce genel bir saç çıkarıcı ile tamamlandı.
- Omurilik T7 hakkında T13 2.5 cm'lik kesi yaparak maruz kalmaktadır. Deri dışında yayılmış ve bağ dokusu, T9, T11 vertebra boyunca kaldırılır.
- Laminektomi T10 seviyesinde
NOT: en deneyler için, laminektomi Şam yaralanma olarak kabul edilir.
- Xylocain Birkaç damla kablosu uyuşturan doku eklenir ve dura mater omurilik dokunmamaya dikkat kaldırılır.
- Dorsal sütun yaralanan ve kas tekrar omurilik dokunmamaya dikkat, yakın sütüre edilir. Son olarak, deri dikiş klipleri ile kapalı sütüre edilir. Buprenorfin (0.1 mg / kg vücut ağırlığı) 48 saat için ya da artık gerekli kadar günde iki kez uygulanmalıdır.
2. Çapraz bağlama
- Euthanization sonra yaralı farelerde L4 ve L5 DRG parçalara ayır. Buz HBSS + proteaz inhibitörleri kokteyl (2 toplam 4 hayvanların her hayvan yaralandı ve 2 sahte DRG) toplam 16 DRG toplayın.
- Kısaca DRG santrifüj, sonra dikkatli bir şekilde 37 HBSS kaldırmak ve 500 ul, PBS + proteaz inhibitörleri kokteyl% 1 formaldehit ekleyin ve 30 dakika boyunca örnek inkübe ° C
KRİTİK ADIM taze, moleküler biyoloji notu formaldehit kullanın.
- Fiksasyon ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe durdurmak için 125 mM glisin ekleyin.
- Kısaca, santrifüj, tampon kapalı aspirat ve 500 ul buz gibi soğuk PBS + proteaz inhibitörleri kokteyl ile doku iki kez yıkayın.
3. Çekirdekler hazırlanması ve kromatin kesme
- PBS kapalı aspire, SDS lizis tamponu 400 ul eklemek, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne transfer ve micropestle yaklaşık 30 vuruş ile doku bozabilir.
KRİTİK ADIM Lizis ve doku bozulması çapraz kromatin iyi bir verim için hayati önem taşımaktadır.
- 8 bakliyat,% 70 çıkış (Bandelin, Sonoplus GM70) her 10 saniyede örnek sonikasyon.
DİKKAT. Kromatin kesme özel sonication için optimize edilmiş olmalıdır kurmak ve kromatin düzgün parçalanma gerçek IP deney çalıştırmadan önce kontrol edilmelidir (bkz. Bölüm 3).
Kromatin NOT: Parçalanma micrococcal nükleaz (MNase) sindirim ile yapılabilir. Genel bir kural olarak, yerel doku kromatin immunoprecipitation MNase sindirim için tercih edilmektedir sonication tarafından parçalanması, sabit doku için tercih edilir. Çapraz bağlı, makaslanmış kromatin 2 ay kadar -80 ° C'de saklanan, ancak tekrarlanan donma / çözülme döngüleri önlemek olabilir.
4. Kromatin sindirim Analizi (önerilir)
- Analiz için makaslanmış kromatin örnek 10 ul çıkarın. 200 mM NaCl örnek ekleyin ve 2 saat için 65 ° C'de inkübe tarafından çapraz bağ ters.
- DNA (bkz. Bölüm 8) arındırmak ve% 1 agaroz jel çalıştırın. DNA uzunluğu yaklaşık 200-1000 bp (Şekil 1) parçalanmış olmalıdır.
Eksik parçalanma azalmış çözünürlük ve yüksek arka plan yol ise kromatin DİKKAT Aşırı parçalanma, sinyal azalması neden olabilir .
5. Immunoprecipitation
- Immunoprecipitation reaksiyonlar sayısı (NOT aşağıya bakınız) belirlemek ve yeni tüp içine eşit örnekleri bölmek. Her birinin hacmi getirChIP tampon + proteaz inhibitörleri kokteyl ile 500 ul.
- Seyreltilmiş numune 5 ul çıkarın ve yeni bir tüp içine aktarmak. Bu,% 1 giriş örnek ve gerektiği kadar (Bölüm 7) -20 ° C'de saklanır.
- Her immunoprecipitation için, uygun antikor veya normal IgG kontrolü ekleyin ve 4 ° C rotasyon ile bir gecede inkübe.
NOT. Immunoprecipitation, sayısı, pozitif kontrol (örneğin Histon H3 antikor) ve negatif kontrol (Normal IgG) belirlerken dikkate alınmalıdır. Her IP için kullanılan antikor miktarı antikorlar arasında değişir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. Bununla birlikte, genellikle 2-10 aralığında g / immunoprecipitation.
- Antikor / protein / DNA kompleksi immunoprecipitate için, ChIP Sınıf Protein G Manyetik Boncuk 30 ul ekleyin ve 2 saat boyunca inkübe 4 ° C dönüş.
6. Yıkama
- Açılan bağlı kromatin-boncuk kompleksi için, manyetik rafa yerleştirilir. Çözelti berrak ve sonra dikkatle süpernatant kaldırmak kadar bekleyin.
- Boncuklar, düşük tuz yıkama 1 ml (ChIP tampon) ekleyin ve inkübe 4 ° C rotasyon ile 3-5 dakika sonra boncuk aşağı çekme ve yıkama adım 6.1 'de kapalı aspire. Toplam 3 yıkama için bu adımı tekrarlayın.
- Boncuklar 1 ml (ChIP tampon + 350 mM NaCl) yüksek tuz yıkama tamponu ekleyin ve sonra, rotasyon ile 3-5 dakika boyunca inkübe boncuk aşağı çekme ve yıkama adım 6.1 'de kapalı aspire.
7. Cross-linking Elüsyon ve ters
- Giriş numuneler -20 ° C, 150 ul ChIP Elüsyon tampon ekleyin ve 7.5 Adım kadar oda sıcaklığında kenara koyun.
- Adım 6.3 her IP örnek için 150 1x ChIP Elüsyon tampon ul ekleyin.
- Bir Thermomixer tüpler koyun ve 65 ° C ile 30 dakika nazik bir vorteks örnekleri kuluçka boncuk kromatin Zehir.
- Manyetik raf boncuk aşağı çekin ve yeni tüp içine dikkatlice yıkandı, kromatin (süpernatant) aktarmak.
- Giriş örnekleri de dahil olmak üzere tüm tüpler için, 2 saat boyunca NaCl ve 40 mikrogram / Proteinaz K ve inkübe reaksiyon 65 ° C 200mm ekleyin.
NOT: elüsyon adım çok oda sıcaklığında gerçekleştirilen olabilir, ama o kadar etkili olabilir.
8. DNA kurtarma
- Adım 7.5 ve 30 saniye boyunca girdap örnekleri Fenol Kloroform / 1 hacim ekleyin.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj maksimum hızda santrifüjleyin.
- Sulu (üst) yeni tüp içine faz, sulu faz 1 hacim kloroform ekleyin ve 30 saniye boyunca girdap dikkatlice kurtarmak.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj maksimum hızda santrifüjleyin.
- Dikkatle yeni tüp içine sulu faz (üst) kurtarmak, sonra buz gibi% 100 etanol, 20 mikrogram / glikojen reaksiyon ve 2.5 hacimli NaOAc 300mm ekleyin.
DİKKAT glikojen gibi bir taşıyıcı, Ayrıca, nispeten küçük ölçekli DNA parçalarının yağış geliştirmek için gereklidir.
- Çökelti DNA için -80 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
NOT: yağış adım, aynı zamanda -20 ° C'de bir gece yapılabilir
- 4, 20 dakika boyunca bir mikrosantrifüj maksimum hızda örnekler Santrifüj ° C
- Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve buz% 70 etanol 300 ul ile çöktürülmüş DNA pelet yıkayın.
- 4, 10 dakika boyunca bir mikrosantrifüj maksimum hızda örnekler Santrifüj ° C
- Dikkatle çok supernatant mümkün kaldırmak ve pelet kurumaya izin verin.
- 20 ul steril H 2 O. içinde süspanse edin Örnekleri PCR için hazır, ya da DNA -20 ° C'de saklanabilir
9 - Temsilcisi Sonuçlar
ChIP siyatik lezyon DRG'ler bir deney bir temsilci sonucu (Şekil 1 ve 2) gösterilir. İlk olarak, parçalanmış DNA uzunluğu yaklaşık 200-1000 bp (Şekil 1). İkinci olarak, protein-43 (GAP-43) sadece bağlı siyatik sinir yaralanması (şerit 4, Şekil 2, 5 ') ilişkili büyüme proksimal organizatörü PCR sinyali aşağıdaki ChIP göstermektedir. PCR sinyal yok hayvan sadece bir sahte yaralanma alır (şerit 3) ve IP (şeritli 5 ve 6) normal IgG serum kullanırken. Özgüllüğü antikor testi için, biz de aynı DNA örnekleri incelendiğinde, ama, bizim herhangi bir doluluk bekleniyor faiz genin 3'-UTR bir bölge algılayan bir kontrol astar set kullandı. PCR sinyalleri, standart PCR denetimleri gibi IP olmayan DNA örnekleri temsil giriş sinyali dışında şerit (şerit 3-6, Şekil 2, 3 '), (1-2 şeritli, figu bulunmadığınare 2). Bu ChIP prosedürü ya da siyatik ya da spinal dorsal kolon yaralanma bir şema (Şekil 3) özetlendiği gibi yapılabilir.
Şekil 1 parçası uzunlukları uygun aralığı sonication tarafından makaslanmış oldu ters çapraz bağlı DNA agaroz jel.
Şekil 2 asetillenmiş p53 GAP-43 siyatik sinir yaralanması 48 saat sonra proksimal promotor bölgesinde bağlar olduğunu gösteren siyatik sinir lezyonu aşağıdaki DRG doku Yarı-kantitatif PCR sonuçları. Kontrol PCR asetillenmiş p53 DNA GAP-43 geni (S = Şam, I = Sakat) 3'-çevrilmemiş bölge (UTR) bulunan bir kontrol bölgesi bağlamak olmadığını aynı DRG doku göstermektedir.
Şekil 3 siyatik sinir lezyonu siteleri ve dorsal sütun yerini gösteren bir diyagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol doğrudan aksonal yaralanma aşağıdaki yetişkin sinir sisteminde aksonal rejenerasyon sırasında kromatin çevre ile ilgili sormak için bir yöntem sağlar. PNS veya merkezi sinir sistemi ya da yaralanma sonraki transkripsiyonel ve epigenetik bir ortam probu ile kromatin immunoprecipitation DRG yaralanma modeli içermektedir. Sevdikleri transkripsiyon faktörü bağlayıcı varsayılan siteleri karakterize etmek istiyorum ve bu sitelerin doluluk hasarına yanıt olarak oluşup oluşmadığını belirlemek için araştırmacılar için özellikle yararlıdır. Bu sitelerin histon ve DNA epigenetik değişiklikler aynı anda izlenebilir. Daha önce de bildirildiği gibi, (Tedeschi ve ark, 2009) benzer bir protokol yüz sinir lezyonu, yüz sinir çekirdekleri beyin disseke ve ChIP tarafından işlenebilir yapılabilir.
Kromatin immunoprecipitation testleri için tipik, protokolde iki kritik adımlar (1) verimli bir parçalanma ve çözünmüş DNA-protein kompleksi ve ilgi protein için iyi bir immunoprecipitation antikor (2) durumu,. Bu iki adımı etkileyebilecek bir sınırlama başlangıç malzemesi düzeyinin düşük olmasıdır. Görece küçük bir miktar doku sağlamak DRG gibi beyin veya omurilik gibi diğer yapılar ile karşılaştırıldığında. Buna ek olarak, DRG farklı kromatin ortamlarında olabilir hangi nöronların yanı sıra glial hücreleri, bir karışımını nüfusun oluşur. Bu heterojen IP sinyaller yol açabilir, ancak bu ihtar, sinir sisteminin alınan en örneklerde mevcut. Olası bir çözüm transgenically floresan etiketli DRG nöron sıralama floresan aktive hücre, (örneğin YFP-H fareler, Bogdan ve ark, 2004) ya da manyetik boncuk (Lee ve ark üzerinden nöronlar immüno-izolasyon sonra ChIP yapmaktır. , 2005). Ancak, bu iki yaklaşım içinde ChIP DRG'ler için valide gereken ve muhtemelen başlangıç materyali miktarının artması gerekecektir.
Biz başarıyla bilinen rejenerasyon ilişkili genlerin promotor çeşitli transkripsiyon faktörleri ve koaktivatörleri için bağlayıcı siteleri belirlemek için bu yöntem kullanılır, ve biz immunoprecipitated DNA tespit etmek için yarı-kantitatif ve kantitatif PCR yöntemleri kullanılmaktadır. Bu protokol bir gelecek Ayrıca son DNA sinyali tespit etmek için araç olarak, ChIP (ChIP-on-chip) kiremitli microarrays kullanımı olabilir. ChIP-on-chip büyük ölçüde yüksek verim tarafsız bir yaklaşım ile tanımlanan transkripsiyon sitelerin sayısı artacaktır. Aynı zamanda iki veya daha fazla transkripsiyon faktörü işbirliği genomik düzeyde etkileşim nasıl çalışması için izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz ince ayar ChIP için yaptığı katkılardan dolayı laboratuar ve Ricco Lindner ilk ChIP deneyleri Andrea Tedeschi yardım için teşekkür etmek isterim. Bu çalışma, Hertie Vakfı tarafından desteklenen; Fortune Grant, Tübingen Üniversitesi, ve DFG DI 1497/1-1 hibe (tüm Simone Di Giovanni verilen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
