Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Summary

Se presenta un método de inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal. El enfoque puede ser utilizado para identificar sitios específicos de factor de transcripción vinculante y la modificación epigenética de las histonas y el ADN importantes para la regeneración de los axones dañados, tanto en el sistema nervioso periférico y central.

Abstract

Axones en el sistema nervioso central (SNC) no se regeneran mientras que en el sistema nervioso periférico (SNP) se regeneran de forma limitada después de la lesión (Teng et al., 2006). Se reconoce que los programas de transcripción esencial para crecimiento de las neuritas y axones se reactivan después de la lesión en el SNP (Makwana et al., 2005). Sin embargo las herramientas disponibles para analizar la regulación de genes neuronales in vivo son limitadas y desafíos.

Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) ofrecen un sistema modelo excelente lesiones ya que tanto el SNC y SNP son inervadas por un axón bifurcado procedentes de la soma mismo. Los ganglios representan una colección discreta de cuerpos celulares en todos los eventos de la transcripción se producen, y proporcionar así una región claramente definida de la actividad transcripcional que puede ser fácilmente reproducible y retirado del animal. Lesiones de las fibras nerviosas en el SNP (nervio ciático, por ejemplo), donde la regeneración axonal ocurre, debe revelar una serie de programas de transcripción que son distintos de los que respondieron a una lesión similar en el sistema nervioso central, donde la regeneración no tiene lugar (por ejemplo, la médula espinal ). Sitios de unión factor de transcripción, histonas y la modificación del ADN resultante de una lesión a cualquiera SNP o sistema nervioso central puede caracterizarse utilizando inmunoprecipitación de cromatina (CHIP).

Aquí se describe un protocolo de chip usando tejido fijado DRG ratón después de una lesión axonal. Esta poderosa combinación ofrece un medio para caracterizar el entorno de la cromatina a favor de la regeneración necesaria para promover la regeneración axonal.

Protocol

1. Columna dorsal ciático y la lesión del nervio

1. El animal se coloca sobre un paño quirúrgico y por debajo de ella un thermopad está presente durante todo el procedimiento, manteniendo la temperatura corporal del ratón a 37 ° C. Todos los animales son anestesiados para una cirugía con una continua isoflurano / O ₂ de la administración. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes del procedimiento.
2. Por lesiones ciático, ambos miembros posteriores son cuidadosamente afeitado y la depilación se ha completado con el removedor de pelo genéricos antes de la limpieza de la piel con alcohol seguido por Betadyne 3 veces.
3. El nervio ciático se expone mediante una incisión de 4 mm posterior y paralela al fémur a la mitad del muslo a través de la piel y mediante la difusión de los músculos además del músculo bíceps femoral con unas pinzas finas.
4. El nervio ciático es expuesto a continuación, lesionado, y la piel se cierra con dos clips de sutura.

NOTA: La misma incisión se realiza para exponer el nervio ciático, pero se sutura la herida cerrada dejando el nervio intacto de la lesión simulada.

5. Por lesiones de la columna dorsal, la parte de atrás del ratón es cuidadosamente afeitado y la depilación se ha completado con el removedor de pelo genéricos antes de la limpieza de la piel con alcohol aerosol / golpe.
6. La médula espinal está expuesta mediante una incisión de 2,5 cm a partir de T7 a T13. La piel se separan, y el tejido conectivo se elimina a lo largo de la vértebra de T9 a T11.
7. La laminectomía se realiza a nivel de T10

NOTA: Para la mayoría de los experimentos, la laminectomía se considera la lesión Sham.

8. Unas pocas gotas de Xylocain se añaden a los tejidos para anestesiar a la cuerda, y la duramadre se retira, prestando atención para no tocar la médula espinal.
9. Las columnas dorsales están lesionados y el músculo se sutura cerca, de nuevo prestando atención para no tocar la médula espinal. Finalmente, la piel se sutura cerrada con clips de sutura. La buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal) se debe administrar dos veces al día durante 48 horas o hasta que ya no son necesarios.

2. Entrecruzamiento

1. Diseccionar DRG L4 y L5 de ratones heridos después de la eutanasia. Recoge un total de 16 GRD en helado HBSS + cóctel de inhibidores de la proteasa (2 heridos y 2 DRG farsa de cada animal para un total de 4 animales).
2. En pocas palabras centrífuga de la DRG, a continuación, retire con cuidado la HBSS y añadir 500 l de formaldehído al 1% en PBS cóctel + inhibidores de la proteasa e incubar la muestra durante 30 minutos a 37 ° C.

Paso crítico. Use formaldehído fresco, de calidad para biología molecular.

3. Añadir 125 mM de glicina para detener la fijación e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
4. En pocas palabras centrífuga, aspirado de buffer, y lavar el tejido dos veces con 500 l helado de PBS cóctel + inhibidores de la proteasa.

3. Los núcleos de preparación y corte de la cromatina

1. Aspirar de PBS, añadir 400 l de tampón de lisis SDS, transferir a un tubo de microcentrífuga de pre-enfriado, y destruir el tejido de alrededor de 30 golpes con la micropestle.

Paso crítico. Lisis y la alteración de los tejidos son de vital importancia para un buen rendimiento de la cromatina reticulada.

2. Sonicar la muestra con 8 pulsos, 10 segundos cada uno en un 70% la producción (Bandelin, Sonoplus GM70).

PRECAUCIÓN. El corte de la cromatina debe ser optimizado para su tratamiento con ultrasonidos en particular configuración y la fragmentación apropiada de la cromatina se debe comprobar antes de ejecutar el experimento IP actual (ver sección 3).

NOTA. La fragmentación de la cromatina también puede ser realizada por micrococcal nucleasa (MNase) la digestión. Como regla general, la fragmentación por ultrasonidos es el preferido para los tejidos fijos, mientras que la digestión se ve favorecida por MNase inmunoprecipitación de la cromatina nativa tejido. Reticulada, la cromatina cortado puede ser almacenado a -80 ° C hasta por 2 meses, pero evitar los ciclos de congelación / descongelación ciclos.

4. Análisis de la digestión de la cromatina (recomendado)

1. Retire 10 l de la muestra de la cromatina cortado para su análisis. Añadir 200 mM de NaCl a la muestra y revertir la reticulación mediante la incubación a 65 ° C durante 2 horas.
2. Purificar el ADN (ver sección 8) y ejecutar un 1% en gel de agarosa. ADN debe ser fragmentada a una longitud de aproximadamente 200-1000 pb (Figura 1).

PRECAUCIÓN. Excesiva fragmentación de la cromatina puede conducir a la señal de disminución, mientras que la fragmentación incompleta dará lugar a la resolución disminuye y el fondo mayor.

5. Inmunoprecipitación

1. Determinar el número de reacciones de inmunoprecipitación (ver nota abajo), y se dividen en partes iguales en tubos de muestras nuevas. Llevar el volumen de cadahasta 500 ml con buffer chip + inhibidores de la proteasa cóctel.
2. Tomar 5 l de la muestra diluida y transferir a un tubo nuevo. Esta es la muestra de 1% de entrada y se almacenan a -20 ° C hasta que sea necesario (Sección 7).
3. Para cada inmunoprecipitación, añade anticuerpo apropiado o normal de control de IgG e incubar a ° C durante la noche con rotación 4.

NOTA. Para determinar el número de inmunoprecipitación, un control positivo (por ejemplo, anticuerpos Histona H3) y un control negativo (normal IgG) debe ser considerado. La cantidad de anticuerpos utilizados para cada IP varía entre los anticuerpos y debe ser determinada empíricamente. Sin embargo, es por lo general dentro de un rango de 2-10? G / inmunoprecipitación.

4. Para inmunoprecipitar su anticuerpo / proteína / ADN, añadir 30 l de chip grado de proteínas G bolas magnéticas y se incuba durante 2 horas a 4 ° C con rotación.

6. Lavado

1. De pull-down obligado cromatina cordón complejo, se coloca el tubo en la rejilla magnética. Espere hasta que la solución es clara y luego retire con cuidado el sobrenadante.
2. Añadir 1 ml de lavado de baja en sal (buffer chip) hasta el talón y se incuba a 4 ° C durante 3-5 minutos con una rotación, a continuación, tire hacia abajo los granos y aspirado de lavado como en el paso 6.1. Repita este paso para un total de 3 lavados.
3. Añadir 1 ml de solución tampón lavado de alta sal (CHIP buffer + 350 mM NaCl) hasta el talón y se incuban durante 3-5 minutos con una rotación, a continuación, tire hacia abajo los granos y aspirado de lavado como en el paso 6.1.

7. Elución y la reversión de cross-linking

1. Tomar las muestras de entrada de la -20 ° C, añadir 150 ml de tampón de elución chip y dejar de lado a temperatura ambiente hasta el Paso 7.5.
2. Añadir 150 ml de buffer de elución 1x chip para cada muestra de IP de Paso 6.3.
3. Colocar los tubos en un termomezclador y eluir la cromatina de los granos mediante la incubación de muestras a 65 ° C durante 30 minutos con agitación suave.
4. Desplegable granos en la rejilla magnética, y con mucho cuidado la transferencia de la cromatina eluido (sobrenadante) en los tubos nuevos.
5. A todos los tubos, incluyendo muestras de su entrada, agregue 200 mM de NaCl y 40 g / reacción de proteinasa K y se incuba a 65 ° C durante 2 horas.

NOTA. La etapa de elución puede realizarse a temperatura ambiente, también, pero podría no ser tan eficiente.

8. ADN de recuperación

1. Añadir 1 volumen de fenol / cloroformo a su paso muestras de 7,5 y agitar durante 30 segundos.
2. Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante 5 minutos.
3. Con cuidado, la recuperación de la acuosa (superior) de fase en los tubos nuevos, agregar 1 volumen de cloroformo a la fase acuosa, y agitar durante 30 segundos.
4. Centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante 5 minutos.
5. Con cuidado, la recuperación de la acuosa (superior) en la fase de tubos nuevos, a continuación, añadir 300 mm de NaOAc, 20 mg / reacción de glucógeno, y 2,5 volúmenes de etanol helado al 100%.

PRECAUCIÓN. La adición de un portador, como el glucógeno, es necesaria para mejorar la precipitación de fragmentos de ADN relativamente pequeño tamaño.

6. Se incuba a 80 ° C durante 2 horas para precipitar el ADN.

NOTA. La etapa de precipitación también se puede realizar durante la noche a -20 ° C.

7. Centrifugar las muestras a la máxima velocidad en una microcentrífuga durante 20 minutos a 4 ° C.
8. Retire con cuidado el sobrenadante y lavar los sedimentos de ADN se precipitó con 300 l de helado de etanol al 70%.
9. Centrifugar las muestras a la máxima velocidad en una microcentrífuga durante 10 minutos a 4 ° C.
10. Retire con cuidado tanto sobrenadante como sea posible y dejar que las bolitas de aire seco.
11. Resuspender en 20 l de H ₂ O. estéril Las muestras ya están listos para PCR, o el ADN puede ser almacenado a -20 ° C.

9. Resultados representante

Un resultado representativo de un experimento de chip en GRD siguientes lesión ciática se muestra (Figuras 1 y 2). En primer lugar, mostrar fragmentación de ADN con una longitud de aproximadamente 200-1000 pb (Figura 1). En segundo lugar, demostrar un chip de señal PCR después del promotor proximal de la proteína asociada al crecimiento-43 (GAP-43) sólo después de la lesión del nervio ciático (carril 4, figura 2, 5 '). No hay señal de PCR se presenta cuando el animal recibe una lesión en la farsa solo (calle 3), y cuando se utiliza el suero normal de IgG para la IP (carril 5 y 6). Para probar la especificidad de los anticuerpos, se analizaron las muestras de ADN mismo, sino que se utiliza un conjunto de cebadores de control que detecta una región en la 3'-UTR de nuestro gen de interés, donde se espera que no la ocupación. Señales de PCR están ausentes de todos los carriles (carriles 3-6, Figura 2, 3 '), a excepción de la señal de entrada, lo que representa no-IP muestras de ADN como los controles estándar de PCR (carriles 1-2, Figure 2). Este procedimiento chip se puede realizar después de una lesión por la columna vertebral dorsal ciático o como se resume en un esquema (Figura 3).

Figura 1. Gel de agarosa de invertir reticulado de ADN que ha sido cortado por ultrasonidos para el rango adecuado de longitudes de los fragmentos.

Figura 2. Semi-cuantitativos de PCR a partir de tejido DRG siguientes lesión del nervio ciático, que muestran que p53 acetilado se une a la GAP-43 región promotora proximal 48 horas después de la lesión del nervio ciático. Control de PCR de la serie DRG mismo tejido que el gen p53 acetilado no se une a una región de control del ADN situado en la región 3 'no traducida (UTR) de la GAP-43 gen (S = Sham, I = lesionados).

Figura 3. Un esquema general que muestra la ubicación de los sitios de lesión en el nervio ciático, y la columna dorsal.

Discussion

Este protocolo proporciona un método de preguntar directamente sobre el medio ambiente de la cromatina durante la regeneración axonal en el sistema nervioso adulto después de una lesión axonal. Se incorpora el modelo de lesión DRG con inmunoprecipitación de cromatina para investigar el entorno de la transcripción y epigenéticos posteriores a la lesión a cualquiera de los SNP o sistema nervioso central. Es particularmente útil para los investigadores que deseen para caracterizar putativo sitios de unión para el factor de transcripción favorito, y para determinar si la ocupación de estos sitios se produce en respuesta a una lesión. Modificación epigenética de las histonas y el ADN en estos sitios también se pueden controlar de forma simultánea. Un protocolo similar se puede realizar después de lesión del nervio facial, que puede ser el núcleo del nervio facial disección del tronco encefálico y procesada por el chip como se informó anteriormente (Tedeschi et al., 2009).

Como es típico para los ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina, dos pasos críticos en el protocolo son: (1) la fragmentación eficiente y la disolución de los complejos ADN-proteína, y (2) la disponibilidad de un anticuerpo inmunoprecipitación bueno para la proteína de interés. Una de las limitaciones que podrían confundir estos dos pasos es el bajo nivel de materia prima. En comparación con otras estructuras como el cerebro o la médula espinal, DRG proporciona una cantidad relativamente pequeña de tejido. Además, DRG se compone de una mezcla de población de neuronas, así como las células gliales, las cuales podrían tener diferentes ambientes de la cromatina. Esto puede llevar a las señales de IP heterogénea, sin embargo esta advertencia está presente en la mayoría de las muestras tomadas del sistema nervioso. Una posible solución es realizar chip después de fluorescencia de células activadas por la clasificación de transgénicamente marcados con fluorescencia neuronas DRG, (ver por ejemplo YFP-H ratones, Bogdan et al., 2004), o inmuno-aislamiento de las neuronas a través de partículas magnéticas (Lee et al. , 2005). Sin embargo, estos dos enfoques deben ser validados por chip en GRD y probablemente necesitará una mayor cantidad de material de partida.

Hemos utilizado con éxito este método para identificar los sitios de unión para varios factores de transcripción y coactivadores en el promotor de los genes conocidos asociados a la regeneración, y hemos utilizado los métodos de PCR tanto semi-cuantitativo y cuantitativo para detectar el ADN immunoprecipitated. Una futura incorporación a este protocolo podría ser el uso de microarrays de baldosas siguiente chip (Chip-on-chip), como medio para detectar la señal de final de ADN. Chip-on-chip aumentaría el número de sitios de transcripción identificados a través de un enfoque imparcial de alto rendimiento. También podría permitir el estudio de cómo dos o más factores de transcripción en cooperación podría interactuar a nivel genómico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x ChIP Buffer	Cell Signaling Technology	7008
2x ChIP Elution Buffer	Cell Signaling Technology	7009
ChIP Grade Protein G Magnetic Beads	Cell Signaling Technology	9006
Magna Grip Rack (8 well)	EMD Millipore	20-400
Chloroform	Merck & Co., Inc.	UN 1888
37% Formaldehyde	Carl Roth Gmbh	CP10.1
10x Glycine Solution	Cell Signaling Technology	7005
Glycogen	Sigma-Aldrich	G1767
10x HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14185
Histone H3 antibody (rabbit)	Cell Signaling Technology	2650
Normal Rabbit IgG	Cell Signaling Technology	2729
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol	Carl Roth Gmbh	A156.1
Protease Inhibitors Cocktail Tablets	Roche Group	04 693 116 001
Proteinase K (20 mg/ml)	Cell Signaling Technology	10012
SDS Lysis Buffer	Upstate, Millipore	20-163