Summary
Wir stellen eine Methode zur Chromatinimmunpräzipitation aus Spinalganglien Gewebe nach axonalen Verletzungen. Der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetische Modifikation von Histon-und DNA wichtig für die Regeneration von verletzten Axonen sowohl in den peripheren und zentralen Nervensystems zu identifizieren.
Abstract
Axone im zentralen Nervensystem (ZNS) nicht regenerieren, während die in das periphere Nervensystem (PNS) regenerieren zu tun, um in begrenztem Umfang nach einer Verletzung (Teng et al., 2006). Es wird anerkannt, dass transkriptionelle Programme unerlässlich für Neuriten und axonale Auswachsen nach Verletzungen im PNS (Makwana et al., 2005) reaktiviert werden. Doch die Werkzeuge zur Verfügung, um neuronale Genregulation in vivo zu analysieren sind begrenzt und oft eine Herausforderung.
Die Spinalganglien (DRG) bieten eine hervorragende Verletzungen Modellsystem, weil beide das ZNS und PNS durch eine gegabelte Axon, die aus dem gleichen soma innerviert. Die Ganglien stellen eine diskrete Ansammlung von Zellkörpern, wo alle transkriptionelle Ereignisse auftreten, und somit eine klar definierte Region transkriptionelle Aktivität, die sich leicht und reproduzierbar aus dem Tier entfernt werden kann. Verletzung von Nervenfasern im PNS (zB Ischiasnerv), wo axonale Regeneration auftritt, sollte man ein Set von Transkriptions-Programme, die sich von denen der Reaktion auf eine ähnliche Verletzung im ZNS, in denen eine Regeneration nicht stattfindet (z. B. Rückenmark ). Websites für Transkriptionsfaktorbindungsstellen, Histon-und DNA-Modifikation aus der Verletzung entweder PNS oder ZNS charakterisiert Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) werden.
Hier beschreiben wir eine ChIP-Protokoll mit festen Maus DRG Gewebe nach axonalen Verletzungen. Diese leistungsstarke Kombination bietet ein Mittel zur Charakterisierung der pro-Regeneration Chromatin Umfeld für die Förderung der axonalen Regeneration.
Protocol
1. Ischias & dorsalen Säule Nervenverletzung
- Das Tier befindet sich auf einem OP-Tuch gelegt und unter eine Thermopad ist während des gesamten Verfahrens anwesend halten die Körpertemperatur der Maus bei 37 ° C. Alle Tiere werden anästhesiert für Chirurgie mit einer kontinuierlichen Isofluran / O 2-Administration. Chirurgische Instrumente sind vor dem Eingriff autoklaviert.
- Für Ischias-Verletzung, sind beide Hinterhand sorgfältig rasiert und Enthaarung mit generischen Haarentferner vor der Reinigung der Haut mit Alkohol Betadyne 3 mal gefolgt abgeschlossen.
- Der Ischiasnerv ist, indem Sie einen 4 mm Inzision posterior und parallel zum Femur der Mitte des Oberschenkels durch die Haut und durch die Verbreitung der Muskeln mit Ausnahme des Bizeps femoris mit feinen Pinzetten ausgesetzt.
- Die exponierte Ischiasnerv wird dann verletzt, und die Haut wird mit zwei Klammern für chirurgische Nähte verschlossen.
HINWEIS: Die gleichen Schnitt gemacht, um den Ischiasnerv aussetzen, aber die Wunde wird vernäht Verlassen der Nerv intakt für die Schein-Verletzungen.
- Für dorsalen Säule Verletzungen, ist die Rückseite der Maus sorgfältig rasiert und Enthaarung mit generischen Haarentferner vor der Reinigung der Haut mit Alkohol Spray / Swipe abgeschlossen.
- Das Rückenmark ist, indem eine 2,5 cm lange Inzision von etwa T7 bis T13 ausgesetzt. Die Haut wird abgesehen, zu verbreiten und das Bindegewebe wird entlang der Wirbel von T9 bis T11 entfernt.
- Eine Laminektomie ist bei T10-Ebene durchgeführt
HINWEIS: Für die meisten Experimente, die Laminektomie gilt als die Sham Verletzungen.
- Ein paar Tropfen Xylocain sind, um das Gewebe hinzugefügt, um das Kabel zu betäuben, und die Dura mater entfernt ist, achten nicht auf das Rückenmark zu berühren.
- Die dorsale Säulen sind verletzt und der Muskel ist zu schließen, vernäht wieder Aufmerksamkeit nicht auf das Rückenmark zu berühren. Schließlich ist die Haut vernäht mit Klammern für chirurgische Nähte. Buprenorphin (0,1 mg / kg Körpergewicht) sollte zweimal täglich für 48 Stunden oder bis sie nicht mehr benötigt, verabreicht.
2. Die Vernetzung
- Dissect L4 und L5 DRG von verletzten Mäusen nach euthanization. Sammle insgesamt 16 DRG in eiskaltes HBSS + Protease-Inhibitoren-Cocktail (2 Verletzte und 2 sham DRG von jedem Tier für insgesamt 4 Tiere).
- Kurz zentrifugieren DRG, dann vorsichtig den HBSS und fügen 500 ul 1% Formaldehyd in PBS + Protease-Inhibitoren-Cocktail und inkubieren Sie die Probe für 30 Minuten bei 37 ° C.
Entscheidender Schritt. Verwenden Sie frische, Molekularbiologie Formaldehyd.
- Add 125 mM Glycin, um die Fixierung und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur zu stoppen.
- Kurz zentrifugieren, absaugen Puffer, und waschen Sie das Gewebe zweimal mit 500 ul eiskaltem PBS + Protease-Inhibitoren-Cocktail.
3. Kerne Vorbereitung und Chromatin Scheren
- Absaugen PBS, fügen Sie 400 ul SDS Lysepuffer, Transfer zu einem vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen und stören das Gewebe mit ca. 30 Schläge mit dem Mikropistill.
Entscheidender Schritt. Lysis und Störungen des Gewebes sind entscheidend für eine gute Ausbeute an vernetztem Chromatin.
- Mit Ultraschall die Probe mit 8 Impulse, 10 Sekunden jeweils bei 70% Leistung (Bandelin, Sonoplus GM70).
VORSICHT. Die Scherung des Chromatins müssen für Ihre speziellen Beschallung optimiert werden eingerichtet und richtige Fragmentierung des Chromatins sollten, bevor Sie die tatsächliche IP-Experiment überprüft werden (siehe Abschnitt 3).
HINWEIS. Fragmentierung des Chromatins könnte auch durch Mikrokokken-Nuclease (MNase) Verdauung durchgeführt werden. Als Faustregel gilt, ist die Fragmentierung durch Beschallung für feste Gewebe bevorzugt, während MNase Verdauung für native Gewebe Chromatinimmunpräzipitation begünstigt wird. Cross-linked kann geschert Chromatin bei -80 ° C bis zu 2 Monate gelagert werden, aber vermeiden Sie wiederholte Frost / Tau-Zyklen.
4. Analyse von Chromatin-Verdauung (empfohlen)
- Entfernen 10 pl Ihrer geschert Chromatin Probe für die Analyse. Add 200 mM NaCl auf die Probe und umgekehrt die Cross-Link durch Inkubation bei 65 ° C für 2h.
- Purify DNA (siehe Abschnitt 8) und führen Sie ein 1% Agarosegel. DNA sollte eine Länge von ca. 200-1000 bp (Abbildung 1) fragmentiert.
VORSICHT. Over-Fragmentierung von Chromatin kann zu einer verminderten Signal führen, während unvollständige Fragmentierung zu einer verminderten Auflösung und erhöhter Hintergrund führen wird.
5. Immunpräzipitation
- Bestimmen Sie die Anzahl der Immunpräzipitation Reaktionen (siehe Hinweis unten), und teilen Proben zu gleichen Teilen in neuen Schläuchen. Bringen Sie die Lautstärke der einzelnenbis zu 500 ul mit ChIP-Puffer + Protease-Inhibitoren-Cocktail.
- Entfernen 5 ul der verdünnten Probe und Überführung in eine neue Röhre. Dies ist Ihr 1% Eingangs-Sample, und es wird bei -20 ° C gelagert werden, bis sie benötigt (§ 7).
- Für jede Immunpräzipitation, fügen Sie entsprechende Antikörper oder normalen IgG-Steuerung und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht mit einer Rotation.
HINWEIS. Bei der Bestimmung der Anzahl der Immunpräzipitation, eine positive Kontrolle (zB Histone H3 Antikörper) und eine negative Kontrolle (Normal IgG) in Betracht gezogen werden. Die Menge der Antikörper für jedes IP verwendet wird, variiert zwischen Antikörpern und muss empirisch ermittelt werden. Allerdings ist es in der Regel innerhalb eines Bereichs von 2-10? G / Immunpräzipitation.
- Um Immunopräzipitat Ihren Antikörper / Protein / DNA-Komplex, fügen Sie 30 ul ChIP Grade Protein G Magnetic Beads und Inkubation für 2 h bei 4 ° C mit Rotation.
6. Waschen
- Um Pull-Down-gebunden Chromatin-Bead-Komplex, platzieren Sie den Schlauch auf die magnetischen Rack. Warten Sie, bis die Lösung klar ist und dann vorsichtig entfernen Sie Ihre Überstand.
- 1 ml salzarme waschen (ChIP-Puffer), die Perlen und inkubieren Sie bei 4 ° C für 3-5 Minuten mit einer Rotation, dann Pull-Down-Perlen und absaugen waschen, wie in Schritt 6.1. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 3 Wäschen.
- 1 ml der hohen Salz-Waschpuffer (ChIP-Puffer + 350 mM NaCl), die Perlen und Inkubation für 3-5 Minuten mit einer Rotation, dann Pull-Down-Perlen und absaugen waschen, wie in Schritt 6.1.
7. Elution und Umkehrung der Vernetzung
- Nehmen Sie Ihre Eingabe Proben aus der -20 ° C, fügen Sie 150 ul ChIP Elutionspuffer und beiseite stellen bei Raumtemperatur bis Step 7.5.
- Add 150 ul 1x ChIP Elutionspuffer für jede IP-Probe aus Schritt 6.3.
- Legen Sie die Rohre in einem Thermomixer und eluieren das Chromatin aus den Kügelchen durch Inkubation Proben bei 65 ° C für 30 Minuten unter leichtem Vortexen.
- Pull-Down-Perlen auf dem magnetischen Rack und transferieren es vorsichtig in den eluierten Chromatin (Überstand) in neue Schläuche.
- Um alle Rohre, einschließlich Ihrer Eingabe Proben, fügen Sie 200 mM NaCl und 40 ug / Reaktion der Proteinase K und Inkubation bei 65 ° C für 2 Stunden.
HINWEIS. Die Elutionsschritt kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, auch, aber es wäre nicht so effizient.
8. DNA-Gewinnung
- Add 1 Volumen Phenol / Chloroform Ihre Proben aus Schritt 7,5 und Vortex für 30 Sekunden.
- Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
- Sorgfältig wieder die wässrige (obere) Phase in neue Schläuche, fügen Sie 1 Volumen Chloroform in die wässrige Phase und Vortex für 30 Sekunden.
- Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
- Sorgfältig wieder die wässrige (obere) Phase in neue Schläuche, dann fügen Sie 300 mM NaOAc, 20 ug / Reaktion von Glykogen und 2,5 Volumina eiskaltem 100% Ethanol.
VORSICHT. Die Zugabe von einem Träger, wie zB die Glykogen, ist notwendig, um die Fällung von relativ kleinen DNA-Fragmenten zu verbessern.
- Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden zur Fällung DNA.
HINWEIS. Die Fällung kann auch über Nacht bei -20 ° C durchgeführt werden
- Zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 20 Minuten bei 4 ° C.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und wäscht das gefällte DNA-Pellets mit 300 ul eiskaltem 70% Ethanol.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 10 Minuten bei 4 ° C.
- Entfernen Sie vorsichtig soviel Überstand wie möglich und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen.
- Resuspendieren in 20 ul sterilem H 2 O. Die Proben sind nun bereit für die PCR oder die DNA kann bei -20 ° C gelagert werden
9. Repräsentative Ergebnisse
Ein repräsentatives Ergebnis einer ChIP Experiment in DRGs folgenden Ischias-Läsion wird angezeigt (Abb. 1 und 2). Zuerst zeigen wir, fragmentierte DNA auf einer Länge von ca. 200-1000 bp (Abbildung 1). Zweitens zeigen wir, eine PCR-Signal folgende Chip von der proximalen Promotors des Wachstums associated protein-43 (GAP-43) nur auf Ischiasnerv Verletzungen (Spur 4, Abbildung 2, 5 "). Kein PCR-Signal vorhanden ist, wenn das Tier eine Farce Verletzungen empfängt nur (Spur 3), und bei der Verwendung von normalen IgG-Serum für die IP (Bahn 5 und 6). Um zu testen, für die Spezifität der Antikörper, analysierten wir die gleichen DNA-Proben, sondern verwendet eine Steuerung Primer, die eine Region erkennt in der 3'-UTR unserer Gen von Interesse, wo keine Belegung erwartet. PCR-Signale fehlen in allen Gassen (Spuren 3-6, Abb. 2, 3 '), außer für das Eingangssignal, was Nicht-IP-DNA-Proben als Standard-PCR-Kontrolle (Spur 1-2, Figure 2). Dieser Chip Verfahren kann entweder nach ischiadicus oder Rückenmarks Spalte Verletzungen durchgeführt werden wie folgt zusammengefasst in einer schematischen (Abbildung 3).
Abbildung 1. Agarosegel der umgekehrten vernetzten DNA, die durch Beschallung wurde auf den richtigen Bereich der Fragmentlängen geschert.
Abbildung 2. Semi-quantitative PCR-Ergebnisse aus DRG Gewebe nach Ischiasnerv Läsion zeigen, dass p53 acetylierten der GAP-43 proximalen Promotor-Region 48 Stunden nach der Verletzung des Ischiasnervs bindet. Kontroll-PCR aus der gleichen DRG Gewebe zeigen, dass p53 acetylierten nicht zu einer Kontrolle DNA-Region in der 3'-untranslatierten Region (UTR) der GAP-43-Gen (S = Sham, I = Verletzte) befindet sich zu binden.
Abbildung 3. Eine allgemeine Diagramm, das den Ort der Läsion Standorte auf den Ischiasnerv und der dorsalen Säule.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet eine Methode, um direkt über die Chromatin-Umgebung stellen während der axonalen Regeneration im adulten Nervensystem folgende axonale Schädigung. Es enthält die DRG Verletzungen Modell mit Chromatin-Immunopräzipitation der Transkriptions-und epigenetische Umgebung im Anschluss an eine Verletzung des PNS oder ZNS entweder Sonde. Es ist besonders nützlich für die Ermittler, die gerne putative Bindungsstellen für ihre Lieblings-Transkriptionsfaktor zu charakterisieren, und würde, um festzustellen, ob die Belegung dieser Sites in Reaktion auf eine Verletzung auftritt. Epigenetische Modifikation von Histonen und DNA an diesen Stellen können auch gleichzeitig überwacht werden. Ein ähnliches Protokoll kann folgende Gesichts Nervenläsion, wo der Facialis Kerne aus dem Hirnstamm zerlegt werden kann und verarbeitet Chip durchgeführt werden, wie wir bereits berichtet (Tedeschi et al., 2009).
Als typisch für Chromatinimmunpräzipitation Assays sind zwei wichtige Schritte in das Protokoll (1), effiziente Fragmentierung und Solubilisierung der DNA-Protein-Komplex, und (2) die Verfügbarkeit einer guten Immunpräzipitation Antikörper für Ihr Protein von Interesse. Eine Einschränkung, dass diese beiden Schritte verwechseln könnte, ist das niedrige Niveau des Ausgangsmaterials. Im Vergleich zu anderen Strukturen, wie das Gehirn oder Rückenmark, DRG eine relativ kleine Menge an Gewebe. Darüber hinaus besteht DRG aus einer Mischung der Bevölkerung von Neuronen sowie Gliazellen, die alle unterschiedliche Chromatin-Umgebungen haben könnte. Dies kann zu heterogenen IP-Signale führen, aber diese Einschränkung ist in den meisten Proben aus dem Nervensystem übernommen. Eine mögliche Lösung besteht darin, ChIP nach Fluoreszenz activated cell sorting der transgen fluoreszenzmarkierten DRG-Neuronen, (siehe zB YFP-H-Mäuse, Bogdan et al., 2004) oder Immun-Isolierung von Neuronen über magnetische Beads (Lee et al durchzuführen. , 2005). Allerdings müssen diese beiden Ansätze für ChIP in DRGs validiert werden und muss wahrscheinlich eine erhöhte Menge des Ausgangsmaterials.
Wir haben erfolgreich diese Methode verwendet, um Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren und Coaktivatoren an den Promotor des bekannten Regeneration assoziierten Gene zu identifizieren, und wir haben beide semi-quantitative und quantitative PCR-Methoden verwendet, um die immunpräzipitiert DNA zu erkennen. Eine zukünftige Zusätzlich zu diesem Protokoll könnte die Verwendung von Fliesen-Mikroarrays folgenden (Chip-on-Chip) werden, als Mittel zur endgültigen DNA-Signal zu detektieren. ChIP-on-Chip würde einer deutlichen Steigerung der Anzahl der identifizierten Transkriptionsfaktoren Standorten über einen hohen Durchsatz unvoreingenommene Herangehensweise. Es könnte auch für die Studie, wie sich zwei oder mehr Transkriptionsfaktor könnte kooperativ auf genomischer Ebene zu interagieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten Andrea Tedeschi für Hilfe bei der Einstellung der anfänglichen Chip-Experimente im Labor und Ricco Lindner für seinen Beitrag zur Feinabstimmung der Bedingungen für ChIP. Diese Arbeit wurde von der Hertie-Stiftung unterstützt, die Fortune-Grant, Universität Tübingen und der DFG DI 1497/1-1 Zuschüsse (alle Simone Di Giovanni gewährt).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
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- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
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- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
