Summary
אנו מציגים שיטה immunoprecipitation הכרומטין מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal. גישה זו יכולה לשמש לזיהוי ספציפי גורם שעתוק אתרי הקישור ושינוי epigenetic של היסטון חשובים ו-DNA של התחדשות של אקסונים נפגע במערכת העצבים ההיקפית שני מרכזי.
Abstract
האקסונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) לא להתחדש בעוד אלה במערכת העצבים ההיקפית (PNS) לעשות להתחדש במידה מוגבלת לאחר פציעה (טנג et al. 2006). הוא זיהה כי תוכניות תעתיק חיוני תולדה neurite ו axonal הם מחדש על פגיעה ב PNS (Makwana et al. 2005). אולם הכלים העומדים לרשותו כדי לנתח ויסות הגנים עצביים in vivo מוגבלים ומאתגר לעיתים קרובות.
הגרעינים השורש הגבי (DRG) מציעים מערכת מעולה מודל פציעה כי הן CNS ו PNS מעוצבבים על ידי האקסון מפוצלת שמקורם סומה זהה. הגרעינים מייצגים אוסף של גופים נפרדים התא שבו כל האירועים תעתיק להתרחש, ובכך לספק אזור מוגדר של פעילות תעתיק כי ניתן להסיר בקלות reproducibly מן החיה. פגיעה של סיבי עצב ב PNS (למשל עצב השת), שבו התחדשות axonal קורה, צריך לחשוף סדרה של תוכניות תעתיק כי נבדלים אלה להגיב פציעה דומה למערכת העצבים המרכזית, שם התחדשות אינו מתקיים (למשל חוט השדרה ). אתרים עבור גורם שעתוק מחייבים, היסטון ושינוי ה-DNA כתוצאה מפגיעה או CNS או PNS ניתן לאפיין באמצעות הכרומטין immunoprecipitation (שבב).
כאן אנו מתארים פרוטוקול CHIP באמצעות רקמות קבוע DRG עכבר בעקבות פציעה axonal. זה שילוב רב עוצמה מספק אמצעי לאפיון הסביבה בעד התחדשות הכרומטין הכרחי לקידום התחדשות axonal.
Protocol
1. הגב עצב השת & עמודה פציעה
- חיה ממוקם על מגבת כירורגית מתחתיו thermopad נוכח בכל ההליך שמירה על טמפרטורת הגוף של העכבר על 37 ° C. כל בעלי החיים מורדמים לניתוח עם הממשל רציף 2 isoflurane קלט / פלט. מכשירי ניתוח הם autoclaved לפני ההליך.
- עבור פגיעה הנשה, באחוריו הן מגולח בקפידה, depilation הושלמה עם מסיר שיער גנרית לפני ניקוי העור עם אלכוהול ואחריו Betadyne 3 פעמים.
- עצב השת הוא נחשף על ידי ביצוע חתך 4 מ"מ אחורי ובמקביל הירך ב אמצע הירכיים דרך העור ועל ידי הפצת השרירים בנפרד של femoris שרירי עם מלקחיים בסדר.
- עצב השת חשוף נפגע אז, את העור סגורה עם שני קליפים תפר.
הערה: חתך אותו הוא עשוי לחשוף את עצב השת, אבל הפצע הוא sutured סגור עוזב העצב שלם עבור הפגיעה דמה.
- עבור פגיעה טור הגבי, החלק האחורי של העכבר הוא מגולח בקפידה, depilation הושלמה עם מסיר שיער גנרית לפני ניקוי העור עם אלכוהול ספריי / לסחוב.
- חוט השדרה הוא נחשף על ידי ביצוע חתך 2.5 ס"מ על T7 ל T13. העור הוא מפושקות, ואת רקמת החיבור מוסר לאורך החוליה מ T9 ל T11.
- Laminectomy מבוצע ברמה T10
הערה: רוב הניסויים, laminectomy נחשבת פציעה שאם.
- כמה טיפות של Xylocain מתווספים הרקמה לטשטש את חוט, ואת מאטר הדורה מוסר, תשומת לב לא לגעת בעמוד השדרה.
- העמודות הגב נפצעים ואת השריר sutured קרוב, שוב לשים לב לא לגעת בעמוד השדרה. בסופו של דבר, העור הוא sutured סגור עם קליפים תפר. עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף) צריכה להינתן פעמיים ביום למשך 48 שעות או עד אין עוד צורך.
2. Cross-linking
- לנתח DRG L4 ו L5 מעכברים נפצעו לאחר euthanization. איסוף כולל של 16 DRG לתוך HBSS קר כקרח + מעכבי פרוטאז קוקטייל (2 נפצעו ו -2 דמה DRG מבעל חיים אחד עבור סכום כולל של 4 בעלי חיים).
- בקצרה בצנטריפוגה DRG, אז בזהירות להסיר את HBSS ולהוסיף 500 μl של פורמלדהיד 1% קוקטייל PBS + מעכבי פרוטאז ו דגירה המדגם במשך 30 דקות על 37 ° C.
שלב קריטי. השתמש טריים, פורמלדהיד ביולוגיה מולקולרית כיתה.
- הוספת 125 mM של גליצין כדי לעצור את הקיבעון ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- בקצרה צנטריפוגות, לשאוב את החיץ, ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 500 μl קוקטייל קר כקרח PBS + מעכבי פרוטאז.
3. גרעינים הכנה הגז הכרומטין
- לשאוב את PBS, להוסיף 400 μl של חיץ תמוגה SDS, להעביר צינור מראש צונן microcentrifuge, ולשבש את הרקמה עם כ 30 משיכות עם micropestle.
שלב קריטי. תמוגה והפרעה הרקמה חיוניים תשואה טובה של הכרומטין crosslinked.
- Sonicate המדגם עם 8 קטניות, 10 כל שנייה במוצא 70% (Bandelin, Sonoplus GM70).
זהירות. מריחה של הכרומטין חייב להיות מותאם sonication הספציפית שלך להגדיר את הפיצול התקין של הכרומטין צריך להיבדק לפני הפעלת הניסוי IP בפועל (ראה סעיף 3).
. הערה פיצול של הכרומטין יכול גם להתבצע על ידי עיכול micrococcal (MNase) nuclease. ככלל אצבע, על ידי פיצול sonication היא המועדפת רקמות קבוע, תוך עיכול MNase הוא המועדף עבור immunoprecipitation רקמות יליד הכרומטין. צולבים, הכרומטין טעון יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C עד 2 חודשים, אך להימנע חזר להקפיא / מחזורי ההפשרה.
4. ניתוח של מערכת העיכול הכרומטין (מומלץ)
- הסר 10 μl של המדגם טעון שלך הכרומטין לניתוח. הוספת 200 mM NaCl של המדגם ולהפוך את צולבות הקישור ידי דוגרים על 65 מעלות צלזיוס למשך 2h.
- לטהר DNA (ראה סעיף 8) ולהפעיל ג'ל 1% agarose. ה-DNA צריך להיות מקוטעת לאורך של כ 200-1000 bp (איור 1).
. זהירות יתר הפיצול של הכרומטין עלול להוביל אות ירד, תוך פיצול שלם תוביל ברזולוציה פחתה והרקע מוגברת.
5. Immunoprecipitation
- לקבוע את מספר התגובות immunoprecipitation (ראה הערה להלן), לחלק דגימות שווה לתוך צינורות חדשים. תביאו את עוצמת הקול של כל אחדעד 500 μl עם חיץ CHIP + מעכבי פרוטאז קוקטייל.
- הסרת 5 μl מדגם בדילול שלך ולהעביר לתוך צינור חדש. זהו מדגם של 1% שלך קלט את זה יאוחסן ב -20 ° C עד הצורך (סעיף 7).
- במשך כל immunoprecipitation, להוסיף או נוגדן מתאים נורמליים לשלוט IgG ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה.
הערה. בעת קביעת מספר immunoprecipitation, ביקורת חיובית (למשל נוגדנים היסטון H3) ו שליטה שלילי (IgG רגילה) צריך להיחשב. כמות הנוגדנים המשמשים IP משתנה בין נוגדנים צריכה להיקבע באופן אמפירי. עם זאת, בדרך כלל בטווח של 20-10? G / immunoprecipitation.
- כדי immunoprecipitate מורכב נוגדן / חלבון / DNA שלך, הוסף 30 μl של השבב חרוזים חלבון G כיתה מגנטית דגירה עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה.
6. כביסה
- כדי הנפתח מורכב הכרומטין-חרוז כבול, במקום הצינור על מתלה מגנטי. המתן עד הפתרון הוא ברור, ואז להסיר בזהירות supernatant שלך.
- הוסף 1 מ"ל של לשטוף מלח נמוכה (חיץ שבב) של חרוזים דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות עם רוטציה, אז הנפתח חרוזים לשאוב את לשטוף כמו בשלב 6.1. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 3 שוטף.
- הוסף 1 מ"ל של חיץ מלח גבוהה לשטוף (חיץ CHIP + 350 mM NaCl) על חרוזים דגירה של 3-5 דקות עם רוטציה, אז הנפתח חרוזים לשאוב את לשטוף כמו בשלב 6.1.
7. Elution ואת היפוך של cross-linking
- קח דגימות הקלט מתוך -20 ° C, להוסיף 150 μl של חיץ elution שבב ומניחים בצד בטמפרטורת החדר עד שלב 7.5.
- הוסף 150 μl של חיץ CHIP 1x elution עבור כל מדגם ה-IP של שלב 6.3.
- מניחים את צינורות thermomixer ו elute הכרומטין מן החרוזים על ידי דוגרים דגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם vortexing עדין.
- הנפתח חרוזים על מתלה מגנטי, ובזהירות להעביר את הכרומטין eluted (supernatant) לתוך צינורות חדשים.
- לכל צינורות, כולל דוגמאות קלט, להוסיף 200mm של NaCl ו - 40 מיקרוגרם / תגובת proteinase K ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
הערה. השלב elution יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, אבל זה יכול להיות לא יעיל באותה מידה.
8. ה-DNA התאוששות
- הוסף 1 נפח של כלורופורם פנול / דגימות שלך שלב 7.5 ו מערבולת למשך 30 שניות.
- צנטריפוגה במהירות המרבית microcentrifuge בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- בזהירות לשחזר את השלב מימית (העליון) לתוך צינורות חדשים, להוסיף 1 נפח של כלורופורם לשלב מימית, והמערבולת למשך 30 שניות.
- צנטריפוגה במהירות המרבית microcentrifuge בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- בזהירות לשחזר את השלב מימית (העליון) לתוך צינורות חדשים, ולאחר מכן להוסיף NaOAc של 300 מ"מ, 20 מיקרוגרם / תגובה של גליקוגן, ו 2.5 כרכים של אתנול קרים כקרח 100%.
זהירות. התוספת של הספק, כגון גליקוגן, היא צריכה לשפר את המשקעים קטנה יחסית של שברי DNA בגודל.
- דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ל-DNA המשקע.
הערה. השלב משקעים יכול גם להתבצע הלילה ב -20 ° C.
- צנטריפוגה דגימות במהירות המרבית microcentrifuge למשך 20 דקות 4 ° C.
- הסר בזהירות את supernatant לשטוף את כדורי ה-DNA זירז עם 300 μl של אתנול קר כקרח 70%.
- צנטריפוגה דגימות במהירות המרבית microcentrifuge למשך 10 דקות 4 ° C.
- מוציאים בזהירות כמה supernatant ככל האפשר ולתת כדורי האוויר יבש.
- Resuspend ב 20 μl של סטרילית H 2 O. דוגמאות מוכנים כעת עבור ה-PCR, או את ה-DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C.
9. נציג תוצאות
התוצאה נציג של ניסוי שבב DRGs הבאים הנגע sciatic מוצג (איורים 1 ו -2). ראשית, עלינו להראות DNA מקוטעת לאורך של כ 200-1000 bp (איור 1). שנית, אנחנו מדגימים את שבב ה-PCR האות הבאה האמרגן הפרוקסימלי של הצמיחה הקשורים חלבון 43 (GAP-43) רק על פגיעה עצבית sciatic (מסלול 4, תרשים 2, 5 '). אין אות PCR קיים כאשר בעל החיים מקבל פציעה דמה בלבד (מסלול 3), בעת שימוש רגיל IgG בסרום עבור ה-IP (מסלול 5 ו - 6). כדי לבדוק את הספציפיות של הנוגדן, ניתחנו את דגימות ה-DNA זהה, אך השתמשו פריימר שליטה מוגדר אשר מזהה אזור 3'-UTR של הגן שלנו עניין בהם לא צפויה תפוסה. אותות ה-PCR נעדרים מכל נתיבים (מסלולים 3-6, איור 2, 3 "), למעט אותות הקלט, המייצג הלא IP דגימות DNA כסטנדרט PCR שולטת (נתיב 1-2, Figuמחדש 2). הליך זה CHIP יכול להתבצע בעקבות פציעה הירך או עמוד השדרה הגבי או בטור כפי שמסוכם סכמטית (איור 3).
1. איור agarose בג'ל של דנ"א צולבים הפוך כי כבר טעון על ידי sonication לטווח התקין של אורך קטע.
איור 2. Semi-PCR כמותי תוצאות מרקמות DRG בעקבות פגיעה בעצב הנשה מראה כי p53 acetylated נקשר GAP-43 באזור האמרגן הפרוקסימלי 48 שעות לאחר פציעה של עצב השת. שליטה PCR מן להראות רקמות זהה DRG כי p53 acetylated אינה מחייבת לאזור השליטה של ה-DNA נמצא באזור 3'-מתורגמים (UTR) של הגן 43-GAP (S = שאם אני = פצוע).
איור 3. תרשים כללי מראה את מיקומם של אתרי הנגע על עצב השת, והעמודה הגבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה לשאול ישירות על הסביבה הכרומטין במהלך רגנרציה axonal במערכת העצבים הבוגרת בעקבות פציעה axonal. היא משלבת את המודל פציעה DRG עם immunoprecipitation הכרומטין לחקור את הסביבה ואת תעתיק epigenetic לאחר פציעה או CNS או PNS. זה שימושי במיוחד עבור החוקרים מי רוצה לאפיין אתרי הקישור המשוער עבור גורם שעתוק האהוב שלהם, כדי לקבוע אם התפוסה של אתרים אלה מתרחשת בתגובה לפציעה. שינוי epigenetic של ההיסטונים ו-DNA באתרים אלה יכולים גם להיות במעקב בו זמנית. פרוטוקול דומה ניתן לבצע את הפעולות הבאות הנגע עצב הפנים, שבו גרעינים עצב הפנים יכול להיות גזור מתוך גזע המוח ומעובדים על ידי שבב כפי שדווח בעבר (טדסקי et al. 2009).
טיפוסי באשר מבחני הכרומטין immunoprecipitation, שני צעדים קריטיים בפרוטוקול הם, (1) פיצול solubilization יעיל של ה-DNA מורכב החלבון, ו (2) על זמינותו של נוגדן immunoprecipitation טוב לחלבון העניין שלך. מגבלה אחת שעשוי לבלבל את שני השלבים היא רמה נמוכה של חומר המוצא. בהשוואה למבנים אחרים כגון המוח או חוט השדרה, DRG לספק כמות קטנה יחסית של רקמת גוף. בנוסף, DRG מורכב האוכלוסייה תערובת של נוירונים, כמו גם ותאי גלייה, אשר כולם אולי הכרומטין סביבות שונות. זה עלול להוביל אותות ה-IP הטרוגנית, אולם סייג זה קיים ברוב דגימות שנלקחו מערכת העצבים. פתרון אפשרי הוא לבצע CHIP לאחר תא פלורסנט מופעל מיון של transgenically נוירונים DRG שכותרתו fluorescently, (ראה למשל YFP-H עכברים, בוגדן et al. 2004), או חיסונית בבידוד של נוירונים באמצעות חרוזים מגנטיים (Lee et al. , 2005). עם זאת, שתי הגישות האלה צריך להיות תוקף עבור שבב DRGs וסביר להניח צורך כמות מוגברת של חומר המוצא.
השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לזהות אתרי קישור לגורמי שעתוק coactivators מספר על האמרגן של גנים הקשורים להתחדשות ידוע, ואנחנו צריכים להשתמש גם וכמותיות וכמותית שיטות PCR לגילוי DNA immunoprecipitated. אחת בנוסף עתידיים פרוטוקול זה יכול להיות בשימוש microarrays רעפים הבאים שבב (שבב על שבב), כאמצעי לזהות את אות ה-DNA הסופי. שבב על השבב יהיה להגדיל באופן משמעותי את מספר אתרי שעתוק מזוהה באמצעות גישה גבוהה משוחדת התפוקה. זה יכול גם לאפשר לחקר איך שני אנשים או יותר גורם שעתוק אולי בשיתוף פעולה אינטראקציה ברמה גנומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות אנדריאה טדסקי לעזרה בקביעת הניסויים CHIP הראשונית של מעבדה Ricco לינדנר על תרומתו לכוונן את התנאים שבב. עבודה זו נתמכה על ידי קרן Hertie; גרנט פורצ'ן, אוניברסיטת Tuebingen, ואת DI DFG מענקים 1497/1-1 (כמובן מאליו כל סימון די ג'ובאני).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
