Summary
Vi presentiamo un metodo per immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale. L'approccio può essere utilizzata per identificare specifici siti di legame fattore di trascrizione e di importanti modificazioni epigenetiche degli istoni e del DNA per la rigenerazione degli assoni danneggiati sia nel sistema nervoso periferico e centrale.
Abstract
Assoni nel sistema nervoso centrale (SNC), non si rigenerano, mentre quelli del sistema nervoso periferico (PNS) si rigenerano in misura limitata dopo l'infortunio (Teng et al., 2006). Si riconosce che i programmi trascrizionali essenziali per la crescita dei neuriti e assonale vengono riattivati su lesioni in PNS (Makwana et al., 2005). Tuttavia gli strumenti disponibili per analizzare regolazione neuronale gene in vivo sono limitati e spesso difficile.
Gangli delle radici dorsali (DRG) offrono un ottimo sistema modello lesioni perché sia il SNC e SNP sono innervate da un assone biforcata provenienti dal soma stesso. I gangli rappresentano una discreta collezione di corpi cellulari in cui tutti gli eventi trascrizionali si verificano, fornendo così una regione ben definita di attività trascrizionale che possono essere facilmente riproducibile e rimosso dall'animale. Lesioni delle fibre nervose nel PNS (es. nervo sciatico), dove la rigenerazione assonale si verifica, dovrebbe rivelare un insieme di programmi trascrizionali che sono distinti da quelli rispondendo a un infortunio simile nel sistema nervoso centrale, in cui la rigenerazione non avviene (per esempio il midollo spinale ). Siti di legame per il fattore di trascrizione, modificazione degli istoni e DNA derivati da lesioni al sistema nervoso centrale sia PNS o possono essere caratterizzati con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP).
Qui, descriviamo un protocollo ChIP utilizzando tessuti fissati DRG del mouse seguente danno assonale. Questa potente combinazione fornisce un mezzo per caratterizzare la pro-ambiente di rigenerazione cromatina necessario per promuovere la rigenerazione assonale.
Protocol
1. Sciatico e dorsale della colonna lesioni nervose
- L'animale è posto su un asciugamano chirurgico e sotto un thermopad è presente in tutto il procedimento mantenendo la temperatura del corpo del mouse a 37 ° C. Tutti gli animali sono anestetizzati per l'intervento chirurgico con un continuo isoflurano / O 2 amministrazione. Gli strumenti chirurgici vengono sterilizzati in autoclave prima della procedura.
- Per lesioni sciatico, sia posteriori sono accuratamente rasata, e depilazione si completa con Epilatore generico prima di pulizia della pelle con l'alcool seguita da Betadyne 3 volte.
- Il nervo sciatico è esposta facendo una incisione 4 millimetri posteriore e parallelo al femore a metà coscia attraverso la pelle e diffondendo i muscoli a parte del bicipite femorale con una pinza sottile.
- Il nervo sciatico è esposta poi ferito, e la pelle è chiusa con due clip sutura.
NOTA: La stessa incisione è fatta per esporre il nervo sciatico, ma la ferita viene suturata chiuso lasciando intatto il nervo per l'infortunio farsa.
- Per lesioni della colonna dorsale, la parte posteriore del mouse è accuratamente rasata, e depilazione si completa con Epilatore generico prima pulizia della pelle con l'alcool spray / swipe.
- Il midollo spinale è esposto facendo una incisione 2,5 cm circa T7 a T13. La pelle è allargate, e il tessuto connettivo viene rimosso lungo la vertebra da T9 a T11.
- Un laminectomia viene eseguita a livello T10
NOTA: Per la maggior parte degli esperimenti, la laminectomia è considerato l'infortunio Sham.
- Alcune gocce di xylocaina vengono aggiunti al tessuto per anestetizzare il cavo, e la dura madre viene rimosso, facendo attenzione a non toccare il midollo spinale.
- Le colonne dorsali sono feriti e il muscolo viene suturata vicino, sempre facendo attenzione a non toccare il midollo spinale. Infine, la pelle viene suturata chiusa con clip sutura. Buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo) deve essere somministrato due volte al giorno per 48 ore o fino a quando non più necessari.
2. Cross-linking
- Sezionare DRG L4 e L5 di topo ferito dopo euthanization. Raccogliere un totale di 16 DRG in ghiacciato HBSS + cocktail di inibitori della proteasi (2 feriti e 2 farsa DRG da ciascun animale, per un totale di 4 animali).
- Centrifugare brevemente il DRG, poi rimuovere con attenzione i HBSS e aggiungere 500 microlitri di 1% di formaldeide in PBS + cocktail di inibitori della proteasi e incubare il campione per 30 minuti a 37 ° C.
PUNTO CRITICO. Usa fresca, formaldeide grado di biologia molecolare.
- Aggiungere 125 mM di glicina per fermare la fissazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- In breve centrifuga, aspirare il tampone, e lavare il tessuto due volte con 500 microlitri ghiaccio PBS freddo cocktail + inibitori della proteasi.
3. Nuclei di preparazione e taglio della cromatina
- Aspirare off PBS, aggiungere 400 ml di tampone di lisi SDS, il trasferimento di un pre-raffreddata provetta, e distruggere il tessuto con circa 30 colpi con la micropestle.
PUNTO CRITICO. Lisi e la rottura del tessuto sono vitali per una buona resa della cromatina reticolato.
- Sonicare il campione con 8 impulsi, 10 secondi ciascuna al 70% di uscita (Bandelin, Sonoplus GM70).
ATTENZIONE. Il taglio della cromatina deve essere ottimizzato per il vostro sonicazione particolare istituiscono e la frammentazione propria della cromatina devono essere controllati prima di eseguire l'esperimento IP effettivo (vedi sezione 3).
NOTA. Frammentazione della cromatina può essere eseguita anche micrococcal nucleasi (MNase) digestione. Come regola generale, la frammentazione mediante ultrasuoni è preferibile per il tessuto fisso, mentre la digestione MNase è favorito per immunoprecipitazione della cromatina natale dei tessuti. Reticolato, cromatina tranciati possono essere conservati a -80 ° C per un massimo di 2 mesi, ma evitare ripetuti cicli gelo / disgelo.
4. Analisi di digestione della cromatina (consigliato)
- 10 ml di rimuovere il campione cromatina tranciati per l'analisi. Aggiungere 200 mM di NaCl al campione e invertire il cross-link di incubazione a 65 ° C per 2 ore.
- Purificare DNA (vedi paragrafo 8) ed eseguire un gel di agarosio all'1%. DNA dovrebbe essere frammentato per una lunghezza di circa 200-1000 bp (Figura 1).
ATTENZIONE. Eccessiva frammentazione della cromatina può portare alla diminuzione del segnale, mentre la frammentazione incompleta porterà a risoluzione ridotta e lo sfondo aumentata.
5. Immunoprecipitazione
- Determinare il numero di reazioni di immunoprecipitazione (vedi nota sotto), e si dividono equamente in campioni di nuovi tubi. Portare il volume di ognifino a 500 microlitri di buffer di ChIP + cocktail di inibitori della proteasi.
- Prelevare 5 ml di campione diluito e il tuo trasferimento in un nuovo tubo. Questo è il vostro esempio l'ingresso 1% e sarà conservato a -20 ° C fino al momento (sezione 7).
- Per ogni immunoprecipitazione, aggiungere anticorpi appropriati o normale controllo IgG e incubare a ° C per una notte con rotazione 4.
NOTA. Nel determinare il numero di immunoprecipitazione, un controllo positivo (ad esempio anticorpi istone H3) e un controllo negativo (Normale IgG) dovrebbe essere considerato. La quantità di anticorpi utilizzati per ogni IP varia tra gli anticorpi e deve essere empiricamente determinato. Tuttavia, è di solito entro un range di 2-10? G / immunoprecipitazione.
- Per la tua immunoprecipitato anticorpi / proteine / DNA complesso, aggiungere 30 ml di perline proteina ChIP Grado G magnetica e incubare per 2 ore a 4 ° C con rotazione.
6. Lavaggio
- Di pull-down legato cromatina-tallone complesso, posizionare il tubo sul sostegno magnetico. Attendere che la soluzione è chiara e poi rimuovere con attenzione il tuo supernatante.
- Aggiungere 1 ml di lavare iposodica (buffer ChIP) ai talloni e incubare a 4 ° C per 3-5 minuti con la rotazione, poi a tendina perline e aspirare fuori lavare come al punto 6.1. Ripetere questo passaggio per un totale di 3 lavaggi.
- Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio ad alta sale (ChIP di buffer + 350 mM NaCl) ai talloni e incubare per 3-5 minuti con la rotazione, poi a tendina perline e aspirare fuori lavare come al punto 6.1.
7. Eluizione e l'inversione del cross-linking
- Prendete il vostro campioni di ingresso fuori dal -20 ° C, aggiungere 150 ml di tampone di eluizione ChIP e mettere da parte a temperatura ambiente fino a Passo 7.5.
- Aggiungere 150 ml di tampone 1x eluizione ChIP per ogni campione IP dal punto 6.3.
- Collocare le provette in un Thermomixer ed eluire la cromatina dal perline incubando i campioni a 65 ° C per 30 minuti con vortexando gentilmente.
- Pull-down perline sul sostegno magnetico, e con attenzione il trasferimento della cromatina eluiti (surnatante) in nuovi tubi.
- Per tutti i tubi, tra cui i campioni di ingresso, aggiungere 200mm di NaCl e 40 mcg / reazione di proteinasi K e incubare a 65 ° C per 2 ore.
NOTA. Il passo eluizione può essere effettuata a temperatura ambiente, anche, ma potrebbe non essere così efficiente.
8. DNA di recupero
- Aggiungere 1 volume di fenolo cloroformio / i vostri campioni dal punto 7.5 e vortex per 30 secondi.
- Centrifugare alla massima velocità in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Con attenzione recuperare il acquosa (superiore) in fase di nuovi tubi, aggiungere 1 volume di cloroformio alla fase acquosa, e vortex per 30 secondi.
- Centrifugare alla massima velocità in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Con attenzione recuperare il acquosa (superiore) in fase di nuovi tubi, quindi aggiungere 300 mm di NaOAc, 20 mg / reazione di glicogeno, e 2,5 volumi di etanolo ghiacciato del 100%.
ATTENZIONE. L'aggiunta di un vettore, come il glicogeno, è necessario per migliorare la precipitazione di frammenti di DNA relativamente piccole dimensioni.
- Incubare a -80 ° C per 2 ore al DNA precipitato.
NOTA. Precipitazione Il passo può essere eseguita anche durante la notte a -20 ° C.
- Centrifugare i campioni alla massima velocità in una microcentrifuga per 20 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere con cura il supernatante e lavare il pellet di DNA precipitato con 300 ml di ghiacciata etanolo al 70%.
- Centrifugare i campioni alla massima velocità in una microcentrifuga per 10 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere con cura il più possibile sovranatante e lasciare che il pellet asciugare all'aria.
- Risospendere in 20 ml di sterili H 2 O. I campioni sono ora pronti per la PCR, o il DNA può essere conservato a -20 ° C.
9. Rappresentante Risultati
Un risultato rappresentativo di un esperimento di ChIP DRG seguente lesione sciatico è dimostrato (figure 1 e 2). In primo luogo, mostriamo DNA frammentato per una lunghezza di circa 200-1000 bp (Figura 1). In secondo luogo, dimostrare un segnale ChIP seguenti PCR dal promotore prossimale della crescita associati proteina-43 (GAP-43) solo su lesioni del nervo sciatico (corsia 4, figura 2, 5 '). Nessun segnale di PCR è presente quando l'animale riceve una lesione farsa solo (corsia 3), e durante l'uso normale IgG sieriche per l'IP (corsia 5 e 6). Per verificare la specificità dell'anticorpo, abbiamo analizzato i campioni di DNA stesso, ma ha utilizzato un set di primer di controllo che rileva una regione nel 3'-UTR del nostro gene di interesse in cui è prevista alcuna occupazione. Segnali di PCR sono assenti da tutte le corsie (corsie 3-6, Figura 2, 3 '), ad eccezione del segnale di ingresso, che rappresenta non IP campioni di DNA di serie controlli PCR (corsie 1-2, Figure 2). Questa procedura ChIP può essere eseguita in seguito sia sciatico o lesioni della colonna vertebrale dorsale come riassunto in uno schema (Figura 3).
Figura 1. Gel di agarosio invertito reticolato del DNA che è stato tranciato da sonicazione alla gamma di lunghezze proprio frammento.
Figura 2. Semi-quantitativa dei risultati della PCR da tessuto DRG dopo lesione del nervo sciatico dimostrando che p53 acetilata lega al GAP-43 regione del promotore prossimale 48 ore dopo la lesione al nervo sciatico. Controllo PCR dallo spettacolo stesso tessuto DRG che p53 acetilata non si lega ad una regione di controllo del DNA si trova nella regione 3'-non tradotta (UTR) del gene della GAP-43 (S = Sham, I = feriti).
Figura 3. Uno schema generale che indica la posizione dei siti di lesione del nervo sciatico, e la colonna dorsale.
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Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo per chiedere direttamente sull'ambiente cromatina durante la rigenerazione assonale nel sistema nervoso adulto seguenti danno assonale. Incorpora il modello DRG lesioni con immunoprecipitazione della cromatina per sondare l'ambiente trascrizionali ed epigenetici successive a lesioni sia alla PNS e CNS. E 'particolarmente utile per gli investigatori che vogliono caratterizzare putativi siti di legame per il loro fattore di trascrizione preferiti, e per determinare se l'uso di questi siti si verifica in risposta al danno. Modificazioni epigenetiche degli istoni e del DNA in questi siti possono anche essere monitorati simultaneamente. Un protocollo simile può essere effettuata a seguito della lesione del nervo facciale, dove i nuclei del nervo facciale può essere sezionato dal tronco cerebrale ed elaborati da ChIP come abbiamo riportato in precedenza (Tedeschi et al., 2009).
Come è tipico per le analisi immunoprecipitazione della cromatina, a due passi fondamentali nel protocollo sono, (1) frammentazione efficiente e la solubilizzazione del DNA-proteina complessa, e (2) la disponibilità di un anticorpo immunoprecipitazione buono per la vostra proteina di interesse. Una limitazione che potrebbe confondere questi due passaggi è il basso livello di materiale di partenza. Rispetto ad altre strutture come il cervello o del midollo spinale, DRG fornire una quantità relativamente piccola di tessuto. Inoltre, DRG è costituito da un mix popolazione di neuroni e cellule gliali, che potrebbe avere diversi ambienti della cromatina. Questo può portare a segnali IP eterogenee, ma questo avvertimento è presente nella maggior parte dei campioni prelevati dal sistema nervoso. Una possibile soluzione è quella di eseguire ChIP dopo fluorescenti delle cellule attivate smistamento di transgenically neuroni fluorescente DRG, (vedi per esempio YFP-H topi, Bogdan et al., 2004), o immuno-isolamento dei neuroni attraverso sfere magnetiche (Lee et al. , 2005). Tuttavia, questi due approcci devono essere convalidati per ChIP in DRG e probabilmente bisogno di una maggiore quantità di materiale di partenza.
Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per identificare i siti di legame per numerosi fattori di trascrizione e coattivatori al promotore di geni noti associati rigenerazione, e abbiamo utilizzato sia semi-quantitativa e quantitativa metodi di PCR per rilevare il DNA immunoprecipitato. Oltre un futuro a questo protocollo potrebbe essere l'uso di microarray piastrelle seguenti ChIP (ChIP-on-chip), come mezzo per rilevare il segnale finale del DNA. ChIP-on-chip aumenterebbe notevolmente il numero dei siti trascrizione identificato attraverso un approccio di alto rendimento imparziale. Si potrebbe anche consentire lo studio di come due o più fattori di trascrizione possono interagire in modo cooperativo a livello genomico.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Andrea Tedeschi per un aiuto nel fissare gli esperimenti ChIP iniziale in laboratorio e Ricco Lindner per il suo contributo per mettere a punto le condizioni per la ChIP. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Hertie; Grant Fortuna, Università di Tuebingen, e la DFG DI concede 1497/1-1 (tutti concessi a Simone Di Giovanni).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
