Summary
我々は、軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からクロマチン免疫沈降法を提示する。アプローチは、特定の転写因子結合部位と末梢および中枢神経系の両方で負傷した軸索の再生のための重要なヒストンとDNAのエピジェネティックな修飾を識別するために使用することができます。
Abstract
中枢神経系における軸索（CNS）、末梢神経系（PNS）のものは、損傷後の限られた範囲内で再生成しない状態が再生しない（総統ら 、2006）。それは、神経突起と軸索伸長に必須の転写プログラムはPNSの損傷（Makwana ら 、2005）により再活性化されていることが認識されている。しかし、in vivoでの神経細胞の遺伝子調節を分析するために利用できるツールは限られており、頻繁に挑戦です。
CNSとPNSの両方が同一の細胞体から発信された二股の軸索によって支配されているため、後根神経節（DRG）は、優秀な傷害のモデルシステムを提供しています。ガングリオンは、すべての転写のイベントが発生する細胞体の離散集合を表すため、容易にかつ再現性の動物から除去することができる転写活性の明確に定義された領域を提供します。軸索再生が発生しないPNS（例えば坐骨神経）、神経線維の損傷、再生が（例えば、脊髄を行われていないCNSにおける同様の傷害に応答するものとは異なる転写一連のプログラムを、明らかにすべき）。ヒストン、結合転写因子とPNSやCNSのいずれかに傷害に起因するDNA修飾のためのサイトは、クロマチン免疫沈降（チップ）を使用して特徴づけることができる。
ここでは、軸索損傷後の固定マウスのDRGの組織を使ってチッププロトコルについて説明します。この強力な組み合わせにより、軸索再生を促進するために必要なプロ再生クロマチン環境を特徴づけるための手段を提供します。
Protocol
1。坐骨＆脊柱の神経損傷
- 動物は、外科用タオルの上に置き、その下thermopadは37マウスの体温を維持℃までの手順全体を通して存在していますすべての動物は、連続的なO /イソフルラン2投与と手術用麻酔する。手術器具は、プロシージャの前にオートクレーブされています。
- 坐骨傷害の場合は、両方の後半部は慎重に剃毛され、そして脱毛前Betadyne 3回に続いて、アルコールで皮膚を洗浄する一般的な脱毛剤で完了します。
- 坐骨神経を4 mmの切開は、後部、経皮半ば腿での大腿骨と平行することで、上質な鉗子を持つ二頭筋大腿から離れて筋肉を分散して公開されます。
- 露出坐骨神経は、負傷で、皮膚は2つの縫合クリップで閉じられます。
注：同一の切開が坐骨神経を露出するために作られていますが、傷が偽の傷害のための神経はそのままにして閉じて縫合される。
- 脊髄後索損傷の場合は、マウスの背面を慎重に剃毛され、そして脱毛は、一般的な脱毛剤は、前のアルコールスプレー/スワイプで皮膚を洗浄することで完了します。
- 脊髄は、T7約からT13に2.5cmの切開を行うことによって公開されます。皮膚は離れて拡散され、そして結合組織は、T9からT11までの椎骨に沿って削除されます。
- 椎弓切除は、T10レベルで実行されます。
注記：ほとんどの実験では、椎弓切除はシャムの傷害とみなされます。
- Xylocainの数滴はコードをanaesthetizeする組織に追加され、硬膜は脊髄に触れないように注意を払って、削除されます。
- 背側の列は負傷していると筋肉が再び脊髄に触れないように注意を払って、近くに縫合する。最後に、皮膚を縫合クリップで閉じて縫合する。ブプレノルフィン（0.1 mg / kg体重）を48時間または不要になるまで1日2回投与する必要があります。
2。架橋
- 安楽死後に負傷したマウスからのL4とL5 DRGを細かく分析。氷冷HBSS +プロテアーゼ阻害剤カクテル（4匹の合計のために各動物から負傷者と2偽DRG 2）に16 DRGの合計を収集する。
- 簡潔にDRGを遠心して、慎重にHBSSを除去し、PBS +プロテアーゼ阻害剤のカクテルの1％ホルムアルデヒド500μLを追加し、37℃で30分間サンプルをインキュベート℃を
重要なステップは、新鮮な、分子生物学グレードのホルムアルデヒドを使用してください。
- 室温で5分間固定し、インキュベートを停止するにはグリシンの125ミリメートルを追加。
- 簡単に言えば、遠心分離バッファをオフに吸引し、そして500μlの氷冷PBS +プロテアーゼ阻害剤のカクテルで二回組織を洗浄する。
3。核の準備とクロマチン断片化
- PBSから吸引し、SDS溶解バッファー400μlを追加、事前に冷却したマイクロ遠心チューブに移す、とmicropestleで約30ストロークで組織を混乱させる。
組織の重要なステップ。溶解および崩壊は、架橋クロマチンの良好な収率のために不可欠です。
- 8パルス、70％出力（Bandelin、Sonoplus GM70）で10秒ごとにサンプルを超音波処理してください。
注意。クロマチンの断片化は、（セクション3を参照）を設定し、クロマチンの適切な断片化は実際のIPの実験を実行する前にチェックすべき特定の超音波処理のために最適化されている必要があります。
クロマチンの注記。フラグメンテーションは、ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）消化によって実行される可能性があります。 MNase消化がネイティブ組織のクロマチン免疫沈降のために支持されている間経験則として、超音波処理により断片化は、固定組織に適しています。クロスリンクされている、断片化クロマチンは、最大2ヶ月まで-80℃で保存しますが、凍結/融解を避けることができます。
4。クロマチン消化の分析（推奨）
- 分析用断片化クロマチンサンプル10μlを削除します。サンプルへのNaCl 200mMのを追加し、2時間、65℃でインキュベートすることにより、クロスリンクを逆に。
- DNAを精製する（セクション8を参照）、1％アガロースゲルを実行します。 DNAは、約200から1000塩基対（図1）の長さに断片化されるべきである。
不完全な断片化が減少解像度と増加の背景につながる一方クロマチンの注意。オーバー断片化は、減少信号につながる可能性があります。
5。免疫沈降
- 免疫沈降反応の数を決定します（下記の注を参照）、と同様に新しいチューブにサンプルを分割する。それぞれのボリュームをもたらす最大500μlまでのChIPバッファー+プロテアーゼ阻害剤のカクテルで。
- あなたの希釈サンプルの5μlを取り出し、新しいチューブに移す。これは1％の入力サンプルであり、必要になるまでは（セクション7）-20℃で保存されます。
- 各免疫沈降のために、適切な抗体または通常のIgGのコントロールを追加し、回転と℃で一晩4℃でインキュベートする。
注記。免疫沈降の数、陽性対照（例えば、ヒストンH3抗体）とネガティブコントロール（ノーマルIgG）を決定するとき考慮されるべきである。各IPのために使用される抗体の量は、抗体間で変化し、経験的に決定する必要があります。しかし、それは通常2〜10の範囲内でしょうか？G /免疫沈降。
- あなたの抗体/タンパク質/ DNA複合体を免疫沈降、沈降グレードプロテインG磁気ビーズ30μlを追加し、4℃で2時間インキュベート° Cを回転した。
6。洗浄
- プルダウンバインドされているクロマチン - ビーズ複合体に、磁気ラック上にチューブを置きます。溶液が透明になるまで待ってから、慎重に上清を取り除く。
- ビーズに低塩の洗浄を1 ml（チップバッファ）を追加し、4℃でインキュベートCを回転で3〜5分間、その後、ビーズをプルダウンし、手順6.1のように洗浄してから吸引。 3回洗浄の合計に対して、この手順を繰り返します。
- ビーズに高い塩の洗浄緩衝液1ml（チップバッファ+ 350 mMのNaCl）を追加し、ビーズをプルダウンし、手順6.1のように洗浄をオフに吸引し、回転で3〜5分間インキュベートする。
7。架橋の溶出と逆転
- 、-20 ° Cからご入力サンプルを取るのChIP溶出バッファー150μLを追加し、ステップ7.5になるまで室温で置いておきます。
- ステップ6.3から各IPサンプルの1 × ChIPの溶出バッファーを150μlを追加。
- サーモミキサーでチューブをセットし、℃で穏やかにボルテックスしながら30分間65℃のサンプルをインキュベートすることにより、ビーズからクロマチンを溶出させる。
- 磁気ラックでビーズをプルダウンし、慎重に新しいチューブに溶出されたクロマチン（上清）を移す。
- すべての入力のサンプルを含むチューブ、、NaClの200mmの追加と65でプロテイナーゼKとインキュベート40μgの/反応℃で2時間まで。
注記。溶出ステップは、あまりにも、室温で行うことができますが、それは効率的でないかもしれません。
8。 DNAの回収
- ステップ7.5および30秒間ボルテックスから試料にフェノール/クロロホルムの1ボリュームを追加します。
- 5分間室温で遠心機で最高速度で遠心する。
- 慎重に水（上側）を新しいチューブに相、水相にクロロホルムの1ボリュームを追加し、30秒間ボルテックスを回復する。
- 5分間室温で遠心機で最高速度で遠心する。
- 慎重に新しいチューブに水（上側）の位相を回復、その後、氷冷100％エタノールの20μg/グリコーゲンの反応、および2.5倍量のNaOAcの300mmの追加。
注意。そのようなグリコーゲンのようなキャリア、のほかは、比較的小さなサイズのDNA断片の沈殿を促進するために必要です。
- ℃で2時間DNAを沈殿-80インキュベートする。
注記。沈殿工程も-20℃で一晩行うことができます。
- 4℃で20分間マイクロ遠心機でサンプルを最高速度で遠心する℃、
- 注意深く上清を除去し、氷冷70％エタノール300μlで沈殿したDNAペレットを洗浄する。
- 4℃で10分間微量遠心機で最高速度で試料を遠心℃に
- 注意深く上清をできるだけ取り除き、ペレットを空気乾燥させる。
- 滅菌H 2 O20μlに再懸濁し現在、サンプルのPCRのための準備ができている、またはDNAは-20℃で保存することができます
9。代表的な結果
坐骨病変は、次のDRGSのChIP実験の代表的な結果は（図1および図2）表示されます。最初に、我々は約200から1000塩基対（図1）の長さに断片化したDNAを示す。第二に、我々は、タンパク質- 43（GAP - 43）のみの時に坐骨神経の損傷（レーン4、図2に、5'）に関連する成長の近位プロモーターからのPCR信号次のチップを示す。ないPCR信号は動物だけ偽の傷害を受信したとき（レーン3）存在しない、とするときにIP（レーン5および6）のために正常なIgG血清を用いて。抗体の特異性をテストするために、我々は、同一のDNAサンプルを分析しますが、占有率が期待されていない関心の私達の遺伝子の3' - UTR内の領域を検出する制御のプライマーセットを使用。 PCRのシグナルは、標準的なPCRコントロールとしての非IP DNAサンプルを表す、入力信号を除いて、すべてのレーン（レーン3-6、図2、3'）から不在である（レーン1-2、ふぃぎゅ再2）。回路図（図3）に要約としてこのチップ手順はどちら坐骨または脊髄後カラムの損傷後に実行することができます。
フラグメントの長さの適切な範囲に超音波処理によってせん断されて逆に架橋されたDNAの図1。アガロースゲル。
図2。アセチル化p53はGAP - 43 48時間坐骨神経損傷後の近位プロモーター領域に結合することを示す坐骨神経の病変は、次のDRGの組織から半定量的PCRの結果。アセチル化p53はGAP - 43遺伝子（S =シャム、I =負傷）の3' -非翻訳領域（UTR）に位置するDNAの制御領域に結合しないことと同じDRGの組織からのコントロールPCRは、show。
図3。坐骨神経で病変部位の位置、および背側の列を示す概略図。
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Discussion
このプロトコルは、直接軸索損傷後の成人の神経系における軸索再生中にクロマチン環境について質問する方法を提供する。それはPNSやCNSのいずれかに傷害に続く転写とエピジェネティックな環境を調べるためにクロマチン免疫沈降法でDRG傷害モデルを搭載しています。それは自分の好きな転写因子のための推定結合部位を特徴づけるために、これらのサイトの占有率は傷害に反応して発生するかどうかを判断したい研究者のために特に有用である。これらの部位のヒストンとDNAのエピジェネティックな修飾も同時に監視することができます。同様のプロトコルは、我々が以前報告したように顔面神経核は脳幹から解剖し、チップが処理可能な顔面神経の病変、以下を行うことができます（テデスキら 、2009）。
クロマチン免疫沈降アッセイ用として典型的な、プロトコルの2つの重要なステップは、DNA -タンパク質複合体の（1）効率的な断片化と可溶化であり、目的タンパク質に適した免疫沈降抗体の（2）可用性。これら2つのステップを混乱させる可能性が一つの制限は、出発原料の低レベルです。このような脳や脊髄などの他の構造に比べて、DRGは、組織の比較的少量を提供しています。さらに、DRGは神経細胞だけでなく、さまざまなクロマチン環境を持っているかもしれないすべてはグリア細胞の混合集団から構成されています。これは、異種のIP信号につながる可能性があります。しかしこの警告は、神経系から採取したほとんどの試料中に存在する。潜在的な解決策は、蛍光活性化遺伝子導入によって蛍光標識されたDRGニューロンの細胞選別、（例えばYFP - Hマウス、ボグダンら 、2004を参照されたい）、または磁気ビーズ（Lee らを介して神経細胞の免疫分離後のチップを実行することです。 、2005）。しかし、これら二つのアプローチがDRGSでのチップのために検証する必要がありますし、可能性の出発物質の増加量が必要になります。
私たちは正常に知られている再生に関連する遺伝子のプロモーターにおけるいくつかの転写因子やコアクチベーターの結合部位を同定するためにこのメソッドを使用している、と我々は、免疫沈降したDNAを検出するために半定量的および定量的PCR法を用いている。このプロトコルの一つの将来的な追加は、最終的なDNAのシグナルを検出する手段として、チップ（チップオンチップ）に続くタイル張りのマイクロアレイを使用する可能性があります。チップオンチップ大幅に高いスループット公平なアプローチを介して同定された転写部位の数を増加させるでしょう。また、2つ以上の転写因子が協調してゲノムレベルでの相互関係についての研究のために可能性があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は微調整ChIPの条件への貢献のために研究室とリコリンドナーで最初のChIP実験のセットアップについて詳しくはアンドレアテデスキに感謝します。この作品は、Hertie財団によってサポートされていました。フォーチュングラント、チュービンゲン大学、およびDFG DI 1497/1-1の助成金を（すべてのシモーネディジョバンニに付与される）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
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