Summary
שיטה יעילה כדי להעריך את פני חשיפה של חלבונים leptospiral מתואר. השיטה היא תוכננה במיוחד כדי למנוע שיבוש של הממברנה החיצונית של התאים leptospiral שביר. טכניקה זו דורשת עבודה של בקרות שלילי מספר להעריך את היושרה של הממברנה החיצונית הספציפיות של תגובת הנוגדנים.
Abstract
חלבונים חיידקיים משטח מעורבים בקשר ישיר עם תאים המארח ספיגת חומרים מזינים מן הסביבה 1. מסיבה זו, לוקליזציה הסלולר יכולים לספק תובנות על תפקיד פונקציונלי של חלבונים חיידקיים. לוקליזציה Surface של חלבונים חיידקיים היא צעד מפתח לקראת זיהוי של גורמים ארסיות מעורבים מנגנונים של pathogenicity.
שיטות fractionating leptospiral 2-5 ממברנות עשוי להיות סלקטיבי לסוג מסוים של הממברנה החיצונית, חלבונים (OMPs), כגון ליפופרוטאינים לעומת OMPs הטרנסממברני, ולכן להוביל misclassification. סביר זאת בשל הבדלים מבניים ואיך הם קשורים אל הממברנה החיצונית. ליפופרוטאינים הקשורים ממברנות באמצעות אינטראקציה הידרופובי בין מחצית N-מסוף השומנים (שלושה חומצות שומן) לבין פוספוליפידים bilayer השומנים 6, 7. לעומת זאת, OMPs הטרנסממברני משולבים בדרך כלל על ידי amphipathic β גיליונות מסודרים במבנה דמוי חבית 8, 9 לתוך bilayer השומנים. בנוסף, הנוכחות של חלבון בקרום החיצוני אינה מבטיחה בהכרח כי חלבון או תחומים שלו חשופים על פני השטח. הקרומים החיצוניים Spirochetal ידועים להיות שיטות שביר ולכן מחייבים מעורבים מניפולציה עדינה של תאים הכללת חלבון משטח משנה שולט על מנת להעריך את שלמות הממברנה החיצונית.
כאן, אנו מציגים assay immunofluorescence (IFA) שיטה ישירות להעריך את החשיפה של חלבונים על פני השטח leptospires ללא פגע. שיטה זו מבוססת על ההכרה של חלבונים פני השטח leptospiral ידי אנטיגן ספציפי לערמונית נוגדנים. בזאת, נוגדנים ספציפיים עבור OmpL54 10 הם detetcted aftero מחייב, epitopes יליד משטח חשוף. השוואה של תגובתיות נוגדנים לתאי שלם לעומת permeabilized מאפשר הערכה של התפלגות סלולרית והאם החלבון מצוי באופן סלקטיבי על פני השטח leptospiral. שלמות של הממברנה החיצונית יש לבחון באמצעות נוגדן אחד או יותר חלבונים מתחת לפני הקרקע, הממוקמת רצוי periplasm.
השיטה משטח IFA ניתן להשתמש כדי לנתח את החשיפה פני השטח של כל חלבון leptospiral שבה נוגדנים ספציפיים זמינים. גם את התועלת והגבלה של השיטה תלויה בשאלה אם הנוגדנים המועסקים מסוגלים להיקשר epitopes הילידים. מאז נוגדנים לעתים קרובות מועלות כנגד חלבונים רקומביננטי, epitopes של הילידים, משטח חשוף חלבונים לא יכול להיות מוכר. עם זאת, שיטת משטח IFA הוא כלי רב ערך ללימוד מרכיבי משטחי חיידקים שלמים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת לא רק עבור leptospires אלא גם שהחיידקים אחרים חיידקים גראם שליליים. לקבלת מסקנות חזקה לגבי משטח החשיפה של OMPs, גישה מקיפה הכוללת מספר שיטות לוקליזציה תא מומלץ 10.
Protocol
1. קיבוע של Leptospira על שקופיות הזכוכית
- Leptospira interrogans הוא פתוגן בכיתה BSL2. עבודה עם תאים חיים זה דורש טיפול מתאים, כגון כפפות, מעבדה מעיל צעדים pipetting במנדף סטרילי-a.
- לגדול Leptospira ב EMJH medium11, בתוספת סרום ארנבת 1% ב 30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים אמצע לשלב מאוחר-log (צפיפות של 5 x 07-05 אוקטובר 10 x 8 תאים / מ"ל) כ 6 ימים.
- קציר את התרבות על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 ~ 7 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את supernatant על ידי שאיפה בעדינות resuspend את הכדור בתוך בופר פוספט (PBS) -5 mM MgCl 2, pH7.2 לריכוז סופי של 5 x 10 8 תאים / מ"ל.
- הוסף 1 מ"ל של השעיה התא היטב כל שני גם שקופיות הזכוכית קאמרית לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 80 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק.
- הסר בזהירות את נוזל המכיל תאים מאוגד על ידי שאיפה.
- תקן חיידקים שלמים שנותרו כדי שקופיות הזכוכית על ידי הוספת 1 מ"ל / היטב paraformaldehyde 2% PBS-5 mM MgCl 2. דגירה של 40 דקות בקצב של 30 ° C. אלו שקופיות יהיה הערכה של השטח נחשפו חלבונים.
- עבור שקופיות בקרה להערכת בתת הקרקע חלבונים, permeabilize הממברנה החיצונית על ידי קיבוע עם% 1 מ"ל / 100 היטב קר כקרח מתנול. דגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. מתנול פועל בכמה דרכים: היא permeabilizes הממברנה החיצונית, denaturates את החלבונים, ומתקן התאים שקופיות הזכוכית.
- הסר לתקן סוכני ידי שאיפה.
2. סימון נוגדנים ספציפיים
- בלוק הלא ספציפית מחייב ידי הוספת 1 מ"ל / היטב חיץ חסימה (Difco Leptospira העשרה EMJH). לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
- לדלל את נוגדן ספציפי (ארנב סרה החיסון או נוגדנים חד שבטיים עכבר, ארנב סרה polyclonal כאן ספציפית OmpL54 10, FlaA1 12, OmpL1 13) מראש החיסונית סרה עכבר או ארנבת סגפן נוזל המכיל אין נוגדן (כאשר נוצלו כפקדי שלילית) חסימת חיץ. דילולים עבור כל נוגדן צריך להיקבע באופן אמפירי בהתאם כייל נוגדנים, אנטיגן נוגדן ריאקטיביות שפע של חלבונים בתא. הטווח המקובל הוא 1:50 עד 1:600.
- הסר את חוצץ חסימת ידי שאיפה ולהוסיף 1 מ"ל / טוב של נוגדנים העיקרי בדילול מלא.
- לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 1h.
- הסר את הנוזל על ידי שאיפה לשטוף שלוש פעמים בארות עם PBS (1 מ"ל / טוב).
3. ויזואליזציה של leptospires
- הוסף 1 מ"ל / טוב של אלקסה פלואוריד 488 שכותרתו נוגדנים משני (או אנטי IgG ארנבת עז או עז אנטי עכבר IgG) מדולל 1:2000 ו חומצות גרעין הניאון כתם, 4'6-diamidino-2-פניל-אינדול dihydrochloride ( DAPI) מדולל לריכוז סופי של 0.25 מיקרוגרם / מ"ל חסימת חיץ. צעד זה מבטיח זיהוי של נוגדן מחייב ואת הנוכחות של כל שהחיידקים עצמאית של נוגדן מחייב, בהתאמה.
- דגירה השקופיות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
- הסר את הנוזל על ידי שאיפה לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS ופעם עם מים מזוקקים (1 מ"ל / טוב).
- הסר את חדרי ואת רצועת דבק מן שקופיות זכוכית ואוויר יבש דקות 10 ~.
- הוסף להאריך בינוני זהב אנטי לדעוך הרכבה (2 x 20 μl לכל שקופית) ו 24 x 50 מ"מ לכסות להחליק.
- דגירה לילה בטמפרטורת החדר בחושך. צעד זה הכרחי על מנת לאפשר הרכבה בינונית לרפא (להקשות).
- חותם את הפתק לכסות עם לק.
- דמיינו את מכתים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות ציאן / כחול זיהוי לסנן DAPI ומסנן זיהוי ירוק אלקסה פלואוריד 488. כדי להבטיח ייצוג מדויק של הדגימות הוא עשה, ודא שאתה להעריך את שטח החדר כולו מדגם זה.
- רשום את הנתונים על ידי הדמיה שדה נציג עבור כל דגימה. כאשר הדמיה אלקסה 488 פלואוריד פלואורסצנציה, לנצל את הזמן חשיפה זהה עבור כל הדגימות. באמצעות זמן חשיפה עקבית יאפשר השוואה מדויקת יותר של תוצאות הבדיקה עם אנטיגנים לעומת שולטת.
4. נציג תוצאות:
דוגמאות לתוצאות משטח IFA עם תאים Leptospira interrogans באמצעות נוגדנים כנגד פני השטח בתת הקרקע החלבונים שמוצג באיור 2. הבדיקה נחשבת חיובית כאשר הקרינה משמעותית זוהה בדגימות עם leptospires שלם של חלבון עניין זה נחשף משטח (איור 2 א). בדרך כלל, בבדיקת חיובי (כאן, פני השטח חשופים OmpL54), עוצמת הקרינה אותו כ הוא ציין גם בתאים שלמים permeabilized (איור 2 א) זה חיוני לכלול שליטה שלילי שלמות הקרום החיצוני באמצעות נוגדנים כנגד מתחת לפני הקרקע , periplasmic עדיף חלבון (למשל leptospiral FlaA1, איור. 2B). רק כאשר הנתונים מראים כי הקרום החיצוני נותר ללא שינוי דוריng את הניסוי, כלומר נוגדנים נגד חלבון משטח משנה לא מגיבים תאים שלמים (לא הקרינה או הקרינה חלשה בהרבה בהשוואה מדגם permeabilized כמו באיור. 2B), ניתן להסיק כי חלבון (ים) של הריבית משטח חשוף. הכללה של ניסויים עם סרה מראש החיסונית (במקרה של נוגדנים polyclonal) כפקד שלילי נוסף הוא חיוני נתונים חד משמעי ולא צריך להיכנע הקרינה משמעותית תאים שלמים או permeabilized (איור 2A, 2C). DAPI כתם יש צורך לדמיין leptospires כאשר תוצאות שליליות (ללא פלואוריד פלואורסצנציה אלקסה 488) הם נצפו. Counterstaining עם יודיד propidium מהווה חלופה מקובלת DAPI.
שיטה זו היא איכותית ולא כמותית כמו הקרינה בהיר יכול להיות בגלל משטח מרובים חשוף epitopes antigenic להיות מוכר אנטיגן אחד ביחס אנטיגנים אחרים של שפע שווה אבל עם epitopes משטח פחות חשוף. לכן בעוצמות הקרינה ניתן להשתמש רק להשוות את התגובה של נוגדנים אותו, כגון תאים שלמים מול permeabilized ועוצמות לא הקרינה בין חלבונים שונים. הבחנה זו חשובה כאשר תוצאה מעורפלת מתקבל שבו הקרינה באופן משמעותי פחות נצפה בתאים שלמים מאשר בתאים permeabilized (איור 2C). כאלה מכך עולה כי גם החלבון נמצא במיקום בתת הקרקע (עם כתמים שאינם ספציפיים קצת רקע של תאים שלמים), הנוגדנים מחייבים מעדיפים שאינם ילידי epitopes חשופים לאחר permeabilization מתנול או חלבון יכול להיות מספר אתרים לוקליזציה כפי שתואר עבור חלבונים ERP ו ELP של החיידק אחר, Borrelia burgdorferi 14. בכל מקרה, התוצאה IFA מעורפלים כגון זה דורש גישות חלופיות כגון biotinylation פני השטח או proteolysis פני השטח כדי לקבוע אם החלבון של עניין הוא משטח חשוף או לא 10.
1. תרשים זרימה תרשים עבור השטח חיסונית הקרינה assay של שהחיידקים Leptospira interrogans. ראשית, 1 מ"ל של השעיה תא מתווסף גם כל אחד שני גם שקופיות קאמרית (לפחות שתי שקופיות עבור כל ניסוי) ו מודגרות עבור leptospires לדבוק. בשלב הבא, leptospires קבועים לשקופיות קאמרית על ידי הוספת 1 מ"ל / היטב paraformaldehyde 2% (PFA) עבור דגימות עם הממברנה החיצונית שלם (OM) ו - 1 מ"ל / גם של 100% מתנול קר דגימות עם permeabilized OM. בשלב הבא, leptospires מודגרת עם נוגדנים להכיר משטח חשוף החלבונים יחד עם נוגדנים בקרה חלבונים מתחת לפני הקרקע (Primary א.ב.) בשעה 30 ° C במשך 90 דקות. לאחר מכן, נוגדנים העיקרי מזוהים על ידי הדגירה עם מ"ל 1 / טוב של אלקסה פלואוריד 488 נוגדנים משני מצומדות. לבסוף, התאים הם דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
2. איור Surface ניתוח immunofluorescence של חלבונים leptospiral. Leptospira שהחיידקים interrogans נבדקו עם סרה החיסונית מראש החיסונית, והתוצאות היו שליליות יחד עם counterstain DAPI להפגין נוכחות שהחיידקים. ירוק מסנן הקרינה היה בשימוש כדי לזהות אלקסה פלואוריד 488 נוגדנים משני שכותרתו מחייב משטח חלבונים חשוף כחול / טורקיז מסנן הקרינה לזהות DAPI מחייב את ה-DNA בתא. א) נחקר Leptospires עם נוגדנים להכיר חלבון משטח חשוף, OmpL54 10. ב) חקר תאים עם נוגדנים כנגד חלבון periplasmic מתחת לפני הקרקע, FlaA1 (שליטה שלילי). ג) תאים נחקר עם נוגדנים נגד leptospiral porin, OmpL1. עקידת סרה ארנב אל leptospires התגלו עם אלקסה פלואוריד 488 מצומדות נגד ארנב שברי עז IgG. כל התמונות נלקחות לאחר חשיפה 4 שניות ארוכות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
משטח IFA שלנו היא טכניקה דומה לזה המשמש כדי להדגים את חשיפת פני השטח של borrelial שונים 15, 16 ו leptospiral 12, 17 חלבונים. הפרטים של השיטה משטח IFA שתוארו כאן נועדו למזער את המניפולציה של תאים, במטרה לשמור על שלמות הממברנה החיצונית תוך ניצול הנטייה של תאים Leptospira לדבוק שקופיות הזכוכית. השיטה כרוכה ריכוז נמוך יותר (2% לעומת 4%) של paraformaldehyde, כביסה עם חיץ, ייצוב הממברנה החיצונית (PBS 5 mM MgCl 2) צעדים כביסה פחות הפרוטוקולים שפורסמו בעבר 12, 17. בנוסף, השטח IFA השיטה שלנו מדגישה את החשיבות של פקדים חיוניים פרשנות נתונים מדויקים. המגבלה של השיטה הוא שהיא דורשת את הזמינות של נוגדנים ספציפיים המסוגלים להכיר משטח חשוף epitope (ים) של החלבון של עניין. במקרים מסוימים, עכבה סטרית ידי חלבונים פני השטח או lipopolysaccharides אחרים יכולים למנוע היווצרות נוגדנים, אנטיגן. עם זאת, שיטת משטח IFA היא טכניקה פשוטה יחסית ישירות להערכת חשיפה פני השטח של חלבונים והוא יכול לשמש גם בתור לעמוד לבד גישה או בתיאום עם טכניקות אחרות, כגון immunogold תיוג, proteolysis פני השטח, וכו '
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי השירות לבריאות הציבור מענק AI-34431 (ל DAH) מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות VA ועל ידי קרנות מחקר רפואי (כדי DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G. The structures of general porins. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
