Summary
Um método eficiente para avaliar a exposição da superfície de proteínas leptospirose é descrito. O método é projetado especificamente para evitar a ruptura da membrana externa das células frágeis leptospirose. Esta técnica exige o emprego de vários controles negativos para avaliar a integridade da membrana externa e especificidade da reação de anticorpos.
Abstract
Proteínas de superfície bacteriana estão envolvidos em contato direto com células do hospedeiro e na absorção de nutrientes do meio ambiente 1. Por esta razão, a localização celular pode fornecer insights sobre o papel funcional de proteínas bacterianas. Localização de proteínas de superfície bacteriana é um passo fundamental para a identificação de fatores de virulência envolvidos nos mecanismos de patogenicidade.
Métodos para fracionamento 05/02 membranas leptospirose pode ser seletivo para uma certa classe de membrana externa proteínas (OMPs), como lipoproteínas contra OMPs transmembrana e, portanto, levar a erros de classificação. Isso provavelmente é devido a diferenças estruturais e como eles estão associados à membrana exterior. Lipoproteínas são associados com as membranas através de uma interação hidrofóbica entre a porção N-terminal de lipídios (três ácidos graxos) e os fosfolipídeos bicamada lipídica 6, 7. Em contraste, OMPs transmembrana são tipicamente integrados na bicamada lipídica por amphipathic β-folhas dispostas em uma estrutura barril do tipo 8, 9. Além disso, a presença de uma proteína na membrana externa, não garante necessariamente que a proteína ou seus domínios estão expostos na superfície. Espiroquetas membranas externas são conhecidos por serem métodos frágil e, portanto, exigir que envolvam a manipulação suave de células e inclusão de sub-superfície da proteína controles para avaliar a integridade da membrana externa.
Aqui, apresentamos um método de ensaio de imunofluorescência (IFA) para avaliar a exposição direta da superfície de proteínas em leptospiras intacta. Este método se baseia no reconhecimento de proteínas de superfície leptospirose pelo antígeno-anticorpos específicos. Nisto, os anticorpos específicos para OmpL54 10 são detetcted aftero ligação a nativa epitopos de superfície exposta. Comparação da reatividade de anticorpos para células intactas contra permeabilizadas permite a avaliação da distribuição celular e se ou não uma proteína é seletivamente presentes na superfície da leptospirose. A integridade da membrana externa devem ser avaliados utilizando anticorpos para uma ou mais proteínas de subsuperfície, preferencialmente localizado no periplasma.
A superfície método IFA pode ser usado para analisar a exposição da superfície de qualquer proteína leptospirose em que anticorpos específicos estão disponíveis. Tanto a utilidade e limitação do método depende se os anticorpos utilizados são capazes de se ligar a epítopos nativa. Desde que os anticorpos são freqüentemente levantadas contra proteínas recombinantes, epítopos de espécies nativas, de superfície exposta proteínas não pode ser reconhecido. No entanto, a superfície método IFA é uma ferramenta valiosa para estudar componentes de superfícies intactas bacteriana. Este método pode ser aplicado não só para leptospiras, mas também outras espiroquetas e bactérias gram-negativas. Para conclusões mais forte sobre as superfícies de exposição de OMPs, uma abordagem abrangente, envolvendo vários métodos de localização de células é recomendada 10.
Protocol
1. Fixação de Leptospira para lâminas de vidro
- Leptospira interrogans é um patógeno BSL2 classe. Trabalhando com células vivas que requer tratamento adequado, como luvas, jaleco e passos de pipetagem em uma capa estéril.
- Crescer Leptospira em EMJH medium11, suplementado com soro de coelho 1% a 30 ° C até atingirem a fase meados log-final (densidade de 5 x 10 7 a 5 x 10 8 células / ml) por aproximadamente 6 dias.
- Colheita da cultura por centrifugação a ~ xg 2000 para 7 min à temperatura ambiente.
- Retire o sobrenadante por aspiração e delicadamente ressuspender o sedimento em tampão fosfato salino (PBS) -5 mM MgCl 2, pH7.2 para uma concentração final de 5 x 10 8 células / ml.
- Adicionar 1 ml de suspensão de células em cada poço de duas lâminas de vidro bem câmara e incubar a 30 ° C por 80 min para permitir que as células aderem.
- Remova cuidadosamente o líquido contendo células não aderente por aspiração.
- Fix restantes bactérias intactas para lâminas de vidro, adicionando 1 ml / poço de paraformaldeído 2% em PBS-5 mM MgCl 2. Incubar por 40 min a 30 ° C. Estes slides será para avaliação da superfície exposta proteínas.
- Para lâminas de controlo avaliar sub-superfície proteínas, permeabilizar a membrana externa, através da fixação com 1 ml / poço de 100% gelada metanol. Incubar a -20 ° C durante 20min. Metanol atua de várias maneiras: ele permeabilizes da membrana externa, denaturates as proteínas, e correções de células para as lâminas de vidro.
- Remover fixação agentes por aspiração.
2. Rotulagem com anticorpos específicos
- Bloco de ligação não específica, adicionando 1 ml / poço de tampão de bloqueio (Difco Leptospira Enriquecimento EMJH). Incubar a 30 ° C por 90 min.
- Diluir o anticorpo específico (soros imune de coelho ou anticorpos monoclonais de rato, os soros de coelho aqui policlonal específico para OmpL54 10, FlaA1 12, e OmpL1 13) e pré-imune de coelho líquido ascítico soros ou mouse que não contém anticorpos (quando utilizados como controles negativos) tampão de bloqueio. Diluições para cada anticorpo têm de ser determinadas empiricamente dependendo título de anticorpos, antígeno-anticorpo reatividade e abundância de proteína na célula. A gama normal é 1:50 a 1:600.
- Remova o tampão de bloqueio por aspiração e adicionar 1 ml / poço de anticorpos primários diluídos.
- Incubar a 30 ° C por 1h.
- Remover o líquido por aspiração e lavar os poços três vezes com PBS (1 ml / poço).
3. Visualização das leptospiras
- Adicionar 1 ml / poço de Alexa Fluor 488-rotulados anticorpos secundários (ou de cabra anti-IgG de coelho ou cabra anti-IgG de rato) diluída 1:2000 e ácidos nucleicos fluorescentes mancha, dicloridrato de 4'6-diamidino-2-fenil-indol ( DAPI) diluída a uma concentração final de 0,25 mg / ml em tampão de bloqueio. Essa etapa assegura a detecção de ligação do anticorpo ea presença de todos os espiroquetas independente da ligação de anticorpos, respectivamente.
- Incubar as lâminas a 30 ° C por 45 min.
- Remover o líquido por aspiração e lavagem dos poços duas vezes com PBS e uma vez com água destilada (1 ml / poço).
- Remove as câmaras ea fita adesiva da lâminas de vidro e ar seco para ~ 10 min.
- Adicionar Prolongar meio anti-fade de Ouro de montagem (2 x 20 l por lâmina) e um 24 x 50 lamínula mm.
- Incubar overnight em temperatura ambiente no escuro. Esta etapa é necessária para permitir que o meio de montagem para curar (endurecer).
- Selar a lamínula com unha polonês.
- Visualize a coloração por microscopia de fluorescência usando um ciano / azul detecção de um filtro para DAPI e um filtro de detecção de verde para Alexa Fluor 488. Para garantir que uma representação precisa das amostras é feita, certifique-se de avaliar a área da câmara inteira para cada amostra.
- Registrar os dados por um campo de imagem representativa de cada amostra. Quando imagem Alexa Fluor 488 fluorescência, use o mesmo tempo de exposição para todas as amostras. Usando um tempo de exposição consistente permitirá uma comparação mais precisa dos resultados, com antígenos de teste versus controles.
4. Resultados representativos:
Exemplos de resultados de superfície IFA com células Leptospira interrogans utilizando anticorpos contra a superfície e sub-superfície proteínas são mostrados na Figura 2. Um teste é considerado positivo quando fluorescência substancial é detectado em amostras com leptospiras intacta para uma proteína de interesse que é superfície exposta (Fig. 2A). Normalmente, em um teste positivo (aqui, de superfície exposta OmpL54), aproximadamente mesma intensidade de fluorescência é observada em células intactas e permeabilizadas (Fig. 2A) É essencial a inclusão de um controle negativo para a integridade da membrana externa, utilizando anticorpos contra uma subsuperfície , de preferência periplasmic proteínas (por exemplo, leptospirose FlaA1, fig. 2B). Somente quando os dados mostram que a membrana externa manteve-se intacta during o experimento, ou seja anticorpos contra uma proteína de superfície-sub não reagir às células intactas (sem fluorescência ou de fluorescência muito mais fraco quando comparado com amostra permeabilizadas como na fig. 2B), pode-se concluir que a proteína (s) de interesse é superfície exposta. Inclusão de experimentos com pré-imune soros (no caso de anticorpos policlonais) como um controle negativo adicional é essencial para dados inequívocos e não deve produzir fluorescência substancial em células intactas ou permeabilizadas (Fig. 2A, 2C). DAPI mancha é necessário para visualizar leptospiras quando os resultados negativos (sem Alexa Fluor 488 fluorescência) são observados. Contracoloração com iodeto de propídio é uma alternativa aceitável para DAPI.
Este método é mais qualitativa do que quantitativa como brilhante fluorescência pode ser devido a múltiplas superfície exposta epítopos antigênicos ser reconhecido em um único antígeno em relação a outros antígenos da abundância iguais, mas com menos epitopos de superfície exposta. Portanto, a intensidade de fluorescência só pode ser usado para comparar a reatividade dos anticorpos mesma, tais como células intactas contra permeabilizadas e intensidades de fluorescência não entre proteínas diferentes. Esta distinção é importante quando um resultado é obtido ambígua onde a fluorescência é significativamente menos observados em células intactas do que em células permeabilizadas (Fig. 2C). Tal resultado indica que tanto a proteína está em uma localização sub-superfície (com alguma coloração de fundo não-específicos de células intactas), os anticorpos são vinculativas preferencialmente para não-nativos epitopos que são expostos após a permeabilização metanol ou uma proteína pode ter múltiplas sítios de localização, conforme descrito para Erp e Elp proteínas de outro espiroqueta, a Borrelia burgdorferi 14. Em ambos os casos, um resultado ambíguo IFA como este requer abordagens alternativas, tais como Biotinilação superfície ou proteólise superfície para determinar se a proteína de interesse é de superfície exposta ou não 10.
Figura Fluxograma 1. Para a superfície de imuno-fluorescência ensaio de espiroquetas Leptospira interrogans. Primeiro, 1 ml de suspensão de células é adicionado a cada poço de slides dois bem-câmara (pelo menos duas lâminas para cada experimento) e incubados por leptospiras aderir. Em seguida, as leptospiras são fixados em lâminas de câmara, adicionando 1 ml / poço de paraformaldeído 2% (PFA) para as amostras com membrana externa intacta (OM) e 1 ml / poço de 100% de metanol frio para amostras com permeabilizadas OM. Em seguida, as leptospiras são incubadas com anticorpos reconhecendo superfície exposta proteínas, juntamente com anticorpos para proteínas de controle de subsuperfície (Primário do Ab) a 30 ° C por 90 min. Então, anticorpos primários são detectados através da incubação com 1 ml / poço de Alexa Fluor 488 conjugados anticorpos secundários. Finalmente, as células são visualizadas por microscopia de fluorescência.
Figura análise de superfície 2. Imunofluorescência de proteínas leptospirose. Espiroquetas Leptospira interrogans foram sondados com soros imunes e pré-imune, e os resultados negativos foram pareados com um contracorante DAPI para demonstrar a presença de espiroquetas. A fluorescência verde filtro foi usado para detectar Alexa Fluor 488 anticorpo marcado secundário ligação a proteínas de superfície exposta e azul / ciano de filtros de fluorescência para detectar DAPI ligação ao DNA da célula. A) leptospiras sondado com anticorpos reconhecendo uma proteína de superfície exposta, OmpL54 10. B) Células sondado com anticorpos contra uma proteína periplasmic subsuperfície, FlaA1 (controle negativo). C) Células sondado com anticorpos contra leptospirose porina, OmpL1. Ligação de soros de coelho para leptospiras foram detectados com Alexa Fluor 488 cabra conjugado fragmentos anti-IgG de coelho. Todas as imagens são tomadas depois de 4 segundos de exposição longa.
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Discussion
Nossa superfície técnica de IFA é semelhante ao utilizado para demonstrar a exposição de superfície de vários borrelial 15, 16 e leptospirose 12, 17 proteínas. Os detalhes do método de superfície IFA aqui descritos são projetados para minimizar a manipulação de células em um esforço para manter a integridade da membrana externa, aproveitando a tendência de células Leptospira para aderir a lâminas de vidro. O método envolve uma menor concentração (2% versus 4%) de paraformaldeído, a lavagem com tampão de membrana externa de estabilização (PBS 5 mM MgCl 2) e menos etapas de lavagem do que os protocolos publicados anteriormente 12, 17. Além disso, nosso método de superfície IFA enfatiza a importância de controles que são essenciais para a interpretação de dados precisos. A limitação do método é que ele requer a disponibilidade de anticorpos específicos que são capazes de reconhecer superfície exposta epítopo (s) da proteína de interesse. Em alguns casos, por impedimento estérico outras proteínas de superfície ou lipopolissacarídeos pode impedir a formação de antígeno-anticorpo. No entanto, a superfície método IFA é uma técnica relativamente simples para avaliar a exposição direta da superfície de proteínas e pode ser usado tanto como um stand alone abordagem ou em conjunto com outras técnicas, tais como immunogold rotulagem, proteólise superfície, etc
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Serviço de Saúde Pública conceder AI-34431 (para DAH) do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e Fundos VA Medical Research (para DAH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
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