Summary
यहाँ हम अर्द्ध मोटी मस्तिष्क स्लाइसें में छवि fluorescently लेबल की कोशिकाओं के लिए एक तेजी से और सरल विधि का वर्णन. हम फिक्सिंग, टुकड़ा करने की क्रिया, और ऑप्टिकली मस्तिष्क के ऊतकों समाशोधन का वर्णन कैसे मानक epifluorescent या confocal इमेजिंग बरकरार तंत्रिका ऊतक के भीतर और व्यक्तिगत कोशिकाओं neuronal नेटवर्क कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. सीटू मस्तिष्क निर्धारण में
* एक 10 मिलीलीटर सिरिंज (28 गेज सुई) फॉस्फेट के साथ भरा तैयार buffered खारा (पीबीएस).
* एक 10 मिलीलीटर सिरिंज (28 गेज सुई) पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ भरा तैयार है. रिजर्व पोस्ट निर्धारण के लिए एक अतिरिक्त पीएफए / पीबीएस के 5-10 मिलीलीटर.
- Avertin या Nembutal के एक घातक खुराक के साथ प्रयोगात्मक माउस intraperitoneally इंजेक्षन.
- एक बार माउस बेहोश है, इथेनॉल के साथ पेट गीला है और एक काग, मोम, या सिलिकॉन elastomer विच्छेदन पिन का उपयोग कर के साथ स्तरित ट्रे के नीचे करने के लिए माउस सुरक्षित. सामना करना पड़ रहा पेट के साथ, सतह के लिए चार पंजे सुरक्षित - उन के रूप में संभव के रूप में व्यापक प्रसार.
- उरोस्थि के स्तर पर संदंश के साथ त्वचा पकड़ो, और जिगर को बेनकाब करने के लिए आड़े कटौती. Laterally और फिर ऊपर कट पसलियों और डायाफ्राम के माध्यम से. रिब ऊतक प्रालंब निकालें और काटने जारी जब तक दिल पहुँचा जा सकता है.
- पियर्स या कटाव सही atrium परिचालित रक्त नाली.
- पीबीएस के बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से छिड़काव द्वारा संचार प्रणाली से अवशिष्ट रक्त फ्लश.
- एक ही सुई के छेद तक पहुँचने, बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से पीबीएस / पीएफए के बाद छिड़काव द्वारा पूरे माउस को ठीक.
2. मस्तिष्क और निष्कर्षण विच्छेदन
- सिर, गर्दन, और cranium से कान नहर और आंख कक्षाओं के आसपास काटने, त्वचा पूर्व से खींच cranium बेनकाब द्वारा पीछा करके त्वचा निकालें.
* 2.2 कदम) का एक उदाहरण के लिए 2.5 चित्रा 2 देखें) - एक हड्डी कैंची का प्रयोग, आँख से आड़े नाक turbinate हड्डियों के माध्यम से सॉकेट में कटौती. प्रत्येक पक्ष के लिए यह मत करो. crosscut आँखें और घ्राण बल्ब के लिए पूर्वकाल होना चाहिए.
- प्रत्येक कान नहर से थैली लंबाई काटो.
- एक छोटे विच्छेदन कैंची का प्रयोग, पश्चकपाल हड्डी एक कान नहर से अन्य सेरिबैलम overlying की थाली में कटौती.
- कैंची के साथ एक ही विच्छेदन, घ्राण बल्ब के स्तर के लिए midline साथ पूर्व से कटौती.
- संदंश का प्रयोग, मस्तिष्क से प्रत्येक हड्डी की थाली निकालने के लिए, ध्यान लेने के किसी भी संयोजी ऊतक निकालने के लिए इतना है कि मस्तिष्क बरकरार जब बंद हड्डी उठाने.
- कटा हुआ ऑप्टिक और कपाल नसों, शीर्ष ग्रीवा कशेरुक में कटौती, और लगानेवाला में मस्तिष्क हटाने.
- 4 में 1-2 घंटे के लिए पोस्ट तय ° सी. धो 3 बार 15 मिनट पीबीएस में प्रत्येक के.
3. Agarose एम्बेडिंग
- पिगलो 2% उच्च शक्ति, कम जेल बिंदु agarose प्रकार आईबी (सिग्मा सूची संख्या: A0576) पीबीएस खारा में माइक्रोवेव ओवन के साथ.
- एक टेस्ट ट्यूब में पिघला हुआ agarose स्थानांतरण. प्लेस तापमान संतुलन जब तक एक गर्म इनक्यूबेटर या पानी स्नान (40 -41 ° डिग्री सेल्सियस) में टेस्ट ट्यूब.
- गोंद cyanoacrylate गोंद (चित्रा 3A) के साथ नमूना सिरिंज के सवार पर तय मस्तिष्क के ऊतकों . संतृप्त समाधान sucrose - पीबीएस के मस्तिष्क के ऊतकों की सतह पर एक पतली परत ब्रश मस्तिष्क स्लाइसें से agarose अंगूठी के बाद रिलीज की सुविधा.
- नीचे सवार आवास (चित्रा 3B) में मस्तिष्क के ऊतकों के साथ सवार ड्रा .
- विंदुक या गोताख़ोर आवास में गर्म agarose डाल, मस्तिष्क के ऊतकों को कवर. Agarose हवा में बुलबुले फँसाने से बचें. Agarose में वायु बुलबुले टुकड़ा गुणवत्ता के साथ समझौता होगा.
- एक ठंडे (0 -25 ° ° सी) द्रुतशीतन ब्लॉक 1 मिनट के लिए सेट करने के लिए agarose (चित्रा 3C). नमूना सिरिंज के साथ दबाना
4. Compresstome साथ मस्तिष्क टुकड़ा सेक्शनिंग
- नमूना Compresstome (चित्रा 3 डी) में मस्तिष्क के ऊतकों युक्त सिरिंज इकट्ठा.
- नमूना सिरिंज की दुकान (3E चित्रा) के साथ बारीकी से उस्तरा ब्लेड के किनारे संरेखित करें .
- पीबीएस समाधान के साथ बफर टैंक भरें.
- सुक्ष्ममापी एक टुकड़ा मोटाई को आगे घुमाएँ agarose मस्तिष्क ऊतक ब्लॉक नमूना सिरिंज के बाहर निकालना.
- सेक्शनिंग प्रक्रिया आरंभ Compresstome के नियंत्रण इकाई पर "शुरू" बटन दबाएँ.
- 4.5) 4.4 कदम) दोहराएँ जब तक वांछित स्लाइस निर्धारित मोटाई पर प्राप्त कर रहे हैं.
- फसल काटने वाले ब्रश या शीशियों या धुंधला पीबीएस (चित्रा 3F) के साथ भरा कुओं विंदुक के साथ मस्तिष्क स्लाइसें.
5. ऑप्टिकल क्लियरिंग
- ग्लिसरॉल के खंड समाधान: पीबीएस 75% खंड तैयार करें.
- एकत्र मस्तिष्क स्लाइसें से आधा पीबीएस धोने की मात्रा बंद डालो (या विंदुक).
- वापस ग्लिसरॉल / पीबीएस के साथ हटाया मात्रा में जोड़ें.
- 4 में सौम्य मिश्रण के साथ संतुलित करने की अनुमति दें डिग्री सेल्सियस स्लाइस सिंक तक.
- 6,4 6,2 कदम) दोहराएँ) जब तक एक अंतिम ग्लिसरॉल एकाग्रता 75% तक पहुँचता है.
- पीबीएस में 90% ग्लिसरॉल के साथ समाधान बदलें और संतुलित अनुमति देते हैं.
* नोट: हवाई बुलबुले परिचय नहीं जबकि ग्लिसरॉल समाधान जोड़ने के लिए ध्यान रखना. समाधान डालो धीरे धीरे और धीरे मिश्रण, के बाद से हवाई बुलबुले वर्दी equilibra के साथ हस्तक्षेप करेगाtion और खत्म किया जा बढ़ते स्लाइड.
6. इमेजिंग के लिए बढ़ते स्लाइस
- एक खुले आयत में डबल पक्षीय सील चिपकने वाला (SA-एस-1L, अनुग्रह जैव - लैब्स) कट करने के लिए एक माइक्रो स्लाइड (Superfrost प्लस 25 के देखा जा सकता क्षेत्र फिट एक्स 1 एक्स 75 मिमी, बिल्ली # 48311-703, VWR ) 2-3 मिमी चौड़े पक्षों के साथ.
- चिपकने वाला टेप एक विंदुक या तूलिका का उपयोग आयत के केंद्र के अंदर मस्तिष्क स्लाइसें प्लेस. कोमल आकांक्षा के साथ अतिरिक्त ग्लिसरॉल निकालें.
- एक तूलिका के साथ वांछित क्रम में स्लाइड पर मस्तिष्क स्लाइसें व्यवस्था करो.
- धीरे कम चिपकने वाला टेप पर कवर (24 X 60 मिमी, बिल्ली 48383-139 #, VWR) ग्लास, देखभाल लेने के लिए हवाई बुलबुले नहीं परिचय. धीरे कांच कवर पर दबाव के लिए चिपकने वाला टेप के साथ संपर्क सुनिश्चित लागू होते हैं.
- स्लाइड और coverglass के बीच किनारों से अतिरिक्त ग्लिसरॉल Aspirate.
- सील स्लाइड और coverslip स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग.
- इमेजिंग पहले सूखे, या स्लाइड बक्से में लंबी अवधि के 4 बजे दुकान दें डिग्री सेल्सियस
7. प्रतिनिधि परिणाम:
प्रसंस्करण, इमेजिंग, और fluorescently लेबल मस्तिष्क के ऊतकों का विश्लेषण तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अपरिहार्य बन गए हैं. इन जांच के कई परिष्कृत आनुवंशिक जोड़तोड़ लक्षित neuronal सबसेट में संवाददाता अभिव्यक्ति, दोनों कम और उच्च संकल्प छवि विश्लेषण द्वारा पीछा प्राप्त करने के लिए आवश्यकता होती है. अक्सर प्रायोगिक और तकनीकी सीमाओं उसी जानवर से असंभव इन डेटा के प्रकार को प्राप्त करने के लिए, या एक तेजी से तरीके से बनाते हैं. ऑप्टिकली को मंजूरी दे दी, फ्लोरोसेंट इमेजिंग एड्स के लिए इस चुनौती में अर्द्ध मोटी मस्तिष्क वर्गों की तैयारी. एक अक्षुण्ण मोटी मस्तिष्क एक आनुवंशिक रूप से संशोधित रेबीज वायरस के साथ लेबल टुकड़ा का एक उदाहरण व्यक्त EGFP इंजीनियर, और epifluorescent और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged चित्रा 4 में दिखाया गया है है और 5 क्रमशः चित्रा. Epifluorescent इमेजिंग के लिए हम एक Leica M205 एफए का उपयोग किया है, और confocal छवि अधिग्रहण के लिए हम एक Zeiss LSM 510 का इस्तेमाल. संलग्न प्रोटोकॉल के रिश्तेदार सादगी के कारण इस विधि ऊतकों से कम से कम एक दिन के एक बदलाव समय के साथ फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त उपयोगी छवि डेटा उपज करने में सक्षम है, और दोनों कम और उच्च संकल्प प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ संगत है.
यदि अन्वेषक अतिरिक्त शवपरीक्षा लेबलिंग तरीकों, immunohistochemical धुंधला हो जाना, को शामिल करने या पतली वर्गों बनाने के लिए चुनता है, प्रोटोकॉल तदनुसार lengthens. हालांकि, ऊपर वर्णित विधि बरकरार मस्तिष्क में महत्वपूर्ण संवाददाता अभिव्यक्ति की स्क्रीनिंग के पैटर्न के लिए एक सरल और अपेक्षाकृत उच्च throughput विधि का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 1 फ्लो चार्ट निर्धारण, विच्छेदन, टुकड़ा करने की क्रिया, समाशोधन, और अर्द्ध मोटी मस्तिष्क स्लाइसें के बढ़ते प्रक्रिया diagraming.
चित्रा 2 अनुक्रमिक काटने कदम के आरेख बरकरार माउस मस्तिष्क निकालने.
चित्रा 3 चरण के लिए माउंट और मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग Compresstome टुकड़ा. ए) superglue का उपयोग सवार काटने पर मस्तिष्क के ऊतकों की नियुक्ति. बी) agarose embedding के लिए सवार में घुड़सवार मस्तिष्क के ऊतकों के नीचे आरेखण. सी) एक agarose मस्तिष्क प्लग एक ठंडा संपीड़न ब्लॉक का उपयोग solidifying. डी Compresstome काटने कक्ष में) agarose मस्तिष्क प्लग और सवार के निवेशन. ई) सवार डिवाइस के razorblade संरेखण. एफ) काटना और Compresstome बफर चेंबर में मस्तिष्क स्लाइसें के संग्रह.
चित्रा 4 ललाट प्रांतस्था व्यक्त बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के माध्यम से एक ग्लिसरॉल को मंजूरी दे दी मस्तिष्क के ऊतकों से मोटी टुकड़ा के लाइट माइक्रोस्कोपी छवियों. ए) एक माउस मस्तिष्क के माध्यम से कोरोनल टुकड़ा (200 मोटी उम) एक वायरल सदिश व्यक्त EGFP के साथ लेबल और एक epifluorescent त्रिविमेक्ष का उपयोग कम संकल्प पर imaged. स्केल बार, 2 मिमी.
चित्रा 5 fluorescently लेबल 5 परत / एक को मंजूरी दे दी मोटी मस्तिष्क टुकड़ा में 6 cortical न्यूरॉन्स के उच्च बढ़ाई छवि. ए) क्षेत्र में प्रकाश डाला (चित्रा 4) के माध्यम से अधिकतम प्रक्षेपण Z ढेर (150 मोटी उम) के उच्च संकल्प confocal छवि. स्केल बार, 25 उम.
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Discussion
फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी, जरूरत के लिए तेजी से स्क्रीन, छवि, और बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर तंत्रिका नेटवर्क का विश्लेषण अमूल्य बन गया है के माध्यम से जांच के लिए neuronal सबसेट लक्ष्य के व्यापक आवेदन को देखते हुए.
उपयोगकर्ता के अनुकूल में vivo electroporation तकनीक में वायरल vectors, और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों के विकास में तकनीकी प्रगति अब लेबल सेल प्रकार की जांच की एक प्रतीत होता है असीमित स्रोत प्रदान करता है. हालांकि, बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों की छवि विश्लेषण अभी भी प्रयोग करने के लिए एक अड़चन बनी हुई है. विधि यहाँ वर्णित है हमारे मस्तिष्क के ऊतकों के विश्लेषण नियमित फ्लोरोसेंट संवाददाताओं को व्यक्त करने के लिए अत्यंत मूल्यवान साबित हो. यह काफी समय के लिए तैयार है और मस्तिष्क वर्गों से ऊतक का विश्लेषण करने की जरूरत truncates, दोनों कम शक्ति और उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ संगत है, immunocytochemistry के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है, अन्य प्रयोगात्मक पशु मॉडल के लिए अनुवाद है, और महत्वपूर्ण बात है, मोटे तौर पर नियमित प्रयोगशाला वातावरण है कि multiphoton इमेजिंग उपकरणों के लिए उपयोग नहीं हो सकता है के लिए लागू. यह महत्वपूर्ण है लेकिन कृपया ध्यान दें, ग्लिसरॉल और अन्य जलीय और कार्बनिक समाधान के साथ कि ऑप्टिकल समाशोधन व्यावहारिक सीमाएं हैं. यहाँ हम 200 मोटी उम मस्तिष्क स्लाइसें के समाशोधन सहायता ग्लिसरॉल के उपयोग का वर्णन. हालांकि इस पद्धति काफी अच्छी तरह से काम करता है 200 उम ऊतकों में इमेजिंग संकल्प में सुधार, हम इस से परे एक सुधार दिखाई नहीं देता. अन्य कार्बनिक सॉल्वैंट्स ऊतक आगे समाशोधन के लिए सक्षम हैं, लेकिन वहाँ हमेशा एक व्यापार है फ्लोरोसेंट संकेत (या निष्कर्षण) के नुकसान के साथ बंद.
ऊपर वर्णित विधि के संभावित बदलाव perstaltic पंप का उपयोग कर छिड़काव में शामिल हैं, अन्य जलीय या जैविक चरण सॉल्वैंट्स कि एफपी प्रतिदीप्ति, इमेजिंग स्वचालित टुकड़ा करने की क्रिया और धारावाहिक के साथ संगत कर रहे हैं के साथ समाशोधन, या बहु फोटॉन micropscopy के साथ बाँधना भी मोटा मस्तिष्क स्लाइसें में इमेजिंग की अनुमति हो सकता है .
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Disclosures
Jian-Qiang काँग Precisionary उपकरण, Inc, कि इस लेख में प्रयोग किया जाता उत्पाद बनाती है एक कर्मचारी है.
Acknowledgments
यह काम McNair फाउंडेशन, NARSAD, और NINDS R00NS064171 03-अनुदान के माध्यम से समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma-Aldrich | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR international | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR international | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | -or equivalent |
References
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