セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

Summary

ここでは、半厚い脳スライスの画像蛍光標識細胞に迅速かつ簡単な方法を説明します。 、固定スライス、および光学的に脳組織をクリアすることによって我々は標準的な落射蛍光または共焦点イメージングが無傷の神経組織内の個々の細胞や神経回路網を可視化するために使用できる方法について説明します。

Abstract

基礎および臨床の両方神経科学の基本的な目標は、より正常と病気の両方脳内の神経細胞に特徴的なアイデンティティ、分子構造、および接続性の​​パターンを理解することです。この向かって、多大な労力は^1-3高解像度の神経解剖学的マップを構築する上に配置されています。光学顕微鏡で分子遺伝学と進化の拡大と神経形態だけでなく、クエリを実行する能力だけでなく、個々の神経細胞とそれらに関連付けられたネットワーク⁴の分子や細胞のメイクアップを歩んできました。げっ歯類のトランスジェニックおよび遺伝子ターゲティング技術を介して神経細胞をマークし、操作する能力の大きな進歩は、今回^5月6日で"プログラム"神経サブセットに調査官を許可する。間違いなく、現代の神経科学に最も影響力の貢献の一つは、重要な記者の拡大を続けるツールボックス^9を得るために彼らのその後のエンジニアリングと並んで^、7-8海洋無脊椎動物の蛍光蛋白質（fps）をコードする遺伝子の探索とクローニングをしている。離散的な神経集団の標的とFPの発現を駆動するために悪用する細胞タイプ特異的プロモーター活性は遺伝的精度で神経解剖学的調査を与える。

ニューロンの工学FPの発現は非常に脳の構造と機能の理解を向上しています。しかし、脳深部の組織で、または三次元の画像の個々の神経細胞とそれらに関連付けられたネットワークは、挑戦を続けている。高脂質含有量に起因する、神経組織はかなり不透明であると自家蛍光を示す。これらの固有の生物物理学的特性は、それが困難な数十ミクロンの深さを超えて標準的な落射蛍光または共焦点顕微鏡を用いて高分解能での蛍光標識された神経細胞を可視化し、イメージすること。この課題の研究者を回避するには、多くの場合、シリアル薄い断面の撮影と再構成法^10、または2光子レーザー走査顕微鏡^11を採用。これらのアプローチの現在の欠点は、それぞれ関連付けられている労働集約型組織の準備、もしくはコスト高の計測です。

ここで、我々は、光クリアとイメージングによる固定半厚いマウスの脳スライスで蛍光標識された細胞を可視化するため、比較的迅速かつ簡単な方法を提示する。添付のプロトコールではの方法について説明します。心臓内の血流、2）解剖と脳全体の除去、3）アガロース、4の固定脳の埋め込 ​​み）新しいビブラトームインストルメンテーションを使用して精密半厚いスライス標本を経由してその場で 1）固定脳組織、5）グリセロール勾配を通じて脳組織をクリア、および6）光学顕微鏡とZ -スタック再建（ 図1）用のガラススライドにマウント。

脳スライスを準備するために我々は、計測の比較的新しい作品が"Compresstome"VF - 200（http://www.precisionary.com/products_vf200.html）と呼ばれる実装しました。この楽器は、他のvibratomesに機能的に似たような機能を持つ電動事前に、ブレードの振動系を搭載した半自動ミクロトームです。他のvibratomesとは異なり、スライスする組織は、ステンレス製シリンダー内にアガロースプラグにマウントされています。組織は、目的のシリンダーから厚さで押し出され、そして前方に進める振動刃でカット。アガロースプラグ/シリンダーシステムは再現性の組織が、取付位置合わせ、および精密切削加工が可能になります。私たちの手、"Compresstome"利回り電気生理学、免疫組織化学、および直接取付、固定組織やイメージングのための高品質の組織切片で。光学清算と組み合わせることで、ここで我々は高分解能蛍光イメージングのための半厚い固定脳スライスの準備を示しています。

Protocol

（1） その場脳固定で

*リン酸塩を充填した10mlのシリンジ（28ゲージの針を）準備生理食塩水（PBS）がバッファされます。
* PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を充填した10mlのシリンジ（28ゲージの針を）準備する。ポスト固定用PFA / PBSの準備金は、さらに5〜10 mlです。

1. AVERTINまたはネンブタールの致死量を実験的にマウスの腹腔内に注入する。
2. マウスが鎮静されると、エタノールで腹部を濡らし、コルク、ワックス、または解剖ピンを使用して、シリコーンエラストマーとの重ねトレーの底にマウスを固定します。腹部を上に向けて、表面に4つの足を確保 - できるだけ広く、それらを広める。
3. 胸骨のレベルで鉗子で皮膚をつかみ、そして肝臓を露出させる横方向のカット。肋骨と横隔膜を通って横方向にしてからカット。リブ組織のフラップを取り外し、心臓がアクセス可能になるまで切削を続けます。
4. ピアースまたは以下略循環血液を排出する右心房。
5. 左心室経由でPBSの灌流によって循環系から残留血液をフラッシュします。
6. 同じ針穴へのアクセス、左心室経由でPBS / PFAのその後の灌流により全体のマウスを修正。

2。解剖と脳の抽出

1. 頭蓋を公開するために前方の皮膚を引っ張ることによって続いて、外耳道と目の軌道の周りにカットすることで頭、首、および頭蓋から皮膚を取り除きます。
   *）2.5にステップ2.2）については、図2を参照してください
2. 骨のはさみを使用して、目から鼻甲介の骨を介してソケットを十字にカット。各サイドに対して、この手順を実行します。クロスカットは、目や嗅球の前方にする必要があります。
3. それぞれの外耳道から眼窩に縦に切る。
4. 小さな解剖鋏を使用して、他の一つ外耳道から小脳の上に横たわって後頭骨の板をカット。
5. 同じ解剖鋏で、嗅球のレベルに正中線に沿って前方にカット。
6. 鉗子を使用して、骨を持ち上げ時の脳は無傷のまま保たれるように、結合組織を除去するために注意しながら、脳から各骨プレートを取り外します。
7. スニップ視神経と脳神経、上部頚椎の椎骨を切断し、固定液に脳を取り除く。
8. 4℃1〜2時間℃の洗浄を3回PBSで各15分のポストフィックス。

3。アガロース包埋

1. 電子レンジでPBS生理食塩水で2％の高強度、低ゲル融点アガロースタイプIBを（A0576シグマのカタログ番号）メルト。
2. 試験管に溶融アガロースを転送する。温度平衡になるまで暖かいインキュベーターまたはウォーターバス（40 ° -41 ° C）における場所の試験管。
3. シアノアクリレート系接着剤（ 図3A）と試料の注射器のプランジャーの上に接着固定された脳組織。脳スライスからのアガロースのリングの後のリリースを容易にするために脳組織の表面の飽和スクロース- PBS溶液の薄層を磨きます。
4. プランジャハウジング（ 図3B）に脳組織でプランジャーを下に描く。
5. ピペットまたは脳組織をカバーする、プランジャハウジングに暖かいアガロースを注ぐ。アガロースに気泡をトラップすることは避けてください。アガロースの気泡は、スライスの品質が損なわれます。
6. 寒さ（-25〜0 °℃）1分間アガロース（ 図3C）を設定するには、ぞっとするブロック。と試料のシリンジクランプ

4。 Compresstomeで脳のスライスをセクショニング

1. Compresstome（ 図3D）に脳組織を含む検体の注射器を組み立てます。
2. 試料の注射器の出口（ 図3E）と密接にカミソリの刃のエッジを合わせます。
3. PBS溶液でバッファタンクをいっぱいに。
4. 試料の注射器のアガロース - 脳組織のブロックを押し出すことを楽しみマイクロつのスライスの厚さを回転させます。
5. セクショニングプロセスを開始するCompresstomeの制御ユニットの"スタート"ボタンを押してください。
6. 希望のスライスが厚さを決定する時に得られるまで、4.5）にステップ4.4）を繰り返します。
7. PBS（ 図3F）を充填したバイアルまたは染色のウェルにブラシまたはピペットで収穫の脳スライス。

5。光のクリア

1. グリセロールの体積ソリューション：：PBS 75パーセント巻を準備します。
2. 収集した脳スライスからのPBS洗浄の半分のボリュームをオフ（またはピペット）注ぐ。
3. グリセロール/ PBSで削除されたボリュームを再び追加します。
4. 4℃で穏やかに混合して平衡化することを許可° Cのスライスのシンクまで。
5. 最後のグリセロール濃度が75％に達するまで）6.4手順6.2）を繰り返します。
6. PBSで90％グリセロールとソリューションを交換し、平衡化することができます。
   *注意：グリセロール溶液を加えながら、気泡を導入するように注意してください。気泡が均一equilibraと干渉するので、徐々にソリューションを注ぎ、軽く混ぜるるとは、取り付けスライドに引き継がれます。

6。スライスは、イメージングのための取り付け

1. マイクロスライド（Superfrostプラス、25 X 75 X 1ミリメートル、猫の表示可能領域に収まるように開いた長方形に両面シールの接着剤（SA - S - 1L、グレースバイオラボ）をカット。＃48311から703、VWR ）2-3 mm幅の側面を持つ。
2. ピペットや絵筆を使って粘着テープの長方形の中心の内側の脳切片を置きます。穏やかな吸引で余分なグリセリンを削除します。
3. 絵筆と目的の順序でスライド上に脳スライスを配置します。
4. 気泡を導入しないように注意しながら粘着テープの上にゆっくりと下カバーガラス（24 X 60 mmの猫。＃48383から139、VWR）、。ゆっくりと粘着テープとの接触を確実にするためにカバーガラス上に圧力を適用する。
5. スライドとカバーガラスの間のエッジからの過剰なグリセロールを吸引除去する。
6. 透明なマニキュアを使用してシールのスライドとカバースリップ。
7. イメージングの前に乾いてから、または4でスライドボックスで、長期保管℃に

7。代表的な結果：

加工、イメージング、および蛍光標識した脳組織を分析するには、神経生物学の研究に不可欠になっています。これらの調査の多くは、低および高解像度の画像解析の両方に続いて、標的神経細胞のサブセットでレポーターの発現を得るために、高度な遺伝子操作が必要です。しばしば実験的および技術的な限界は、それが不可能に同じ動物からのデータの、または迅速な方法でこれらの型を得ることができる。この挑戦の蛍光イメージングエイズのための光学クリア、半厚い脳切片の調製。急行EGFPに設計さ遺伝子組み換え狂犬病ウイルスで標識された無傷の厚い脳スライスの例、および落射蛍光と共焦点顕微鏡を用いて画像を図4および図5に示されています。落射蛍光イメージングのために我々は、ライカM205 FAを用い、共焦点画像取得のために我々はツァイスLSM 510を使用していました。添付のプロトコルの比較的単純なため、このメソッドは1日未満のターンアラウンド時間と蛍光レポーターを発現する組織から有用な画像データをもたらすことができ、両方の低および高解像度の光学顕微鏡と互換性があります。

調査員が追加の死後標識方法、免疫組織化学染色を、組み込むか、シンナーのセクションを作ることを選択した場合、プロトコルに応じて長くなる。しかしながら、上記の方法はそのまま脳に不可欠なレポーター発現のスクリーニングパターンのための単純で比較的ハイスループットメソッドを表します。

図1固定、解剖、スライス、クリア、および半厚い脳スライスの取り付け手順をdiagramingフローチャート。

図2。無傷のマウスの脳を抽出するためにシーケンシャル切削手順の図。

図3。Compresstomeを使用して脳組織をマウントし、スライスする手順。瞬間接着剤を使用してプランジャーを切断の上に脳組織のA）の配置。 B）アガロース包埋のためのプランジャーに取り付けられた脳組織ダウン描く。 C）チルド圧縮ブロックを用いてアガロース脳のプラグを固める。 Compresstomeカッティングチャンバにアガロースの脳のプラグとプランジャのD）挿入。プランジ​​ャーのデバイスへの黒人のE）アライメント。 Compresstomeバッファチャンバ内への脳スライスのF）切断とコレクション。

図4。強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現する前頭皮質を介してグリセロール-クリア脳組織からの厚いスライスの光学顕微鏡像。マウスの脳を介して）冠状スライス（厚さ200 UM）は、ウイルスベクターを発現するEGFPで標識し、落射蛍光ステレオスコープを用いて低解像度で画像化。スケールバーは2mm。

図5。蛍光標識層5 /クリア厚い脳スライス6皮質ニューロンの高倍率画像。でハイライト領域（図4）を介して最大投影Z -スタック（厚さ150ミクロン）の）高分解能共焦点画像。スケールバー、25ええと。

Discussion

光学顕微鏡、急速に画面の必要性、画像、経由して調査のための神経細胞のサブセットをターゲットにし、無傷の脳組織内にニューラルネットワークを分析する蛍光タンパク質を使用しての広範な応用を考えると非常に貴重となっています。

ユーザーフレンドリーなウイルスベクターの開発における技術的進歩は、 生体内エレクトロポレーション技術、及び遺伝子組み換えマウス系統で 、現在調査するというラベルの種類の細胞表面上は無制限のソースを提供します。しかし、無傷の脳組織の画像解析は、まだ実験してボトルネックのまま。ここで説明する方法は、蛍光レポーターを発現している脳組織の我々のルーチン分析のための非常に貴重であることが実証されています。それは大幅に免疫細胞と組み合わせて使用​​することができる、他の実験動物モデルに翻訳可能な、そして重要なことは、広くなる、、脳切片から組織を準備し、分析するために必要な時間を切り捨てて、低消費電力と高分解能蛍光イメージングの両方と互換性があります。多光子イメージング機器へのアクセス権を持っていない可能性がありますルーチンラボ環境に適用。しかし注意することが重要であり、グリセロールおよび他の水溶液と有機溶媒とその光学決済は実用的な制限があります。ここでは、厚さ200ミクロンに脳スライスのクリアを支援するために、グリセロールの使用を説明しています。このメソッドは最大200 UMの組織でのイメージングの分解能を向上させるために非常にうまく動作しますが、我々はこれ以上の改善が見られない。他の有機溶剤は、さらに組織をクリアすることが可能な、しかし、蛍光信号の損失（または抽出）とのトレードオフが常にあります。

上記の方法の可能なバリエーションはFP蛍光と互換性のある他の水性または有機相の溶媒を用いてクリアperstalticポンプを用いて灌流、、スライス自動化されたシリアルイメージング、あるいは厚い脳スライスのイメージングを可能にする多光子micropscopyとのペアリングが含まれる場合があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bone scissors	F.S.T.	16044-10	-or equivalent
dissection scissors	F.S.T.	14084-08	-or equivalent
type I-B agarose	Sigma-Aldrich	A0576
Compresstome	Precisionary Instruments	VF-200	-other vibratomes are compatible
double sided adhesive	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L
Superfrost Plus slides	VWR international	48311-703
Cover glass	VWR international	48383-139
glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	-or equivalent