Summary
Burada yarı kalın beyin dilimleri görüntü floresan işaretli hücrelerin hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Sabitleme, dilimleme, beyin dokusu ve optik temizleme standart epifluorescent veya konfokal görüntüleme, sağlam sinir dokusu içinde bireysel hücreleri ve nöral ağların görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Abstract
, Hem temel ve klinik nörobilim temel bir hedefi, kimlikler, moleküler makyaj, ve hem de normal ve hastalıklı beyin nöronları için karakteristik bağlantı desen daha iyi anlamak için. Bu doğru, büyük bir çaba, yüksek çözünürlüklü nöroanatomik haritalar 1-3 bina yerleştirilmiştir . Moleküler genetik ve ışık mikroskobu gelişmeler genişleme nöronal morfolojileri sadece sorgulama yeteneği gelir, aynı zamanda bireysel nöronlar ve bunların ilişkili ağları 4 moleküler ve hücresel makyaj gelmiştir. Kemirgen transgenik ve gen hedefleme teknolojileri yoluyla nöron işareti ve manipüle etme yeteneği büyük gelişmeler olacak 5-6 'program' nöronal komutlara araştırmacılar izin verir. Muhtemelen, en etkili çağdaş nörobilim katkılarından biri hayati gazetecilere giderek genişleyen bir araç kutusu 9 verim 7-8, sonraki mühendislik yanında deniz omurgasızları floresan proteinleri (FP) kodlayan genlerin keşfi ve klonlama olmuştur . Ayrık nöron popülasyonları hedef FP ifade sürücü istismar hücre tipine spesifik promotor aktivitesi genetik hassasiyetle nöroanatomik soruşturma tanıyor.
Nöronlarda Mühendisliği FP ifade beyin yapısı ve işlevi anlayışımızı büyük ölçüde geliştirdi. Ancak, derin beyin dokularında, ya da üç boyutlu görüntüleme bireysel nöronlar ve bunların ilişkili ağlar, bir meydan okuma olarak kalmıştır. Yüksek lipid içeriği nedeniyle, sinir dokusu oldukça donuk ve sergiler otomatik floresan. Bu içsel biyofiziksel özellikleri zor onlarca mikron derinliklerde ötesinde standart epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak yüksek çözünürlükte floresan etiketli nöronlar görselleştirmek ve görüntü olun. Bu meydan okuma araştırmacılar aşmak için sık sık seri ince kesitli görüntüleme ve rekonstrüksiyon yöntemleri 10, veya 2-foton lazer tarama mikroskopisi 11 kullanmaktayız. Bu yaklaşımların Şu sakıncaları sırasıyla ilişkili emek-yoğun doku hazırlanması, veya maliyet-engelleyici enstrümantasyon.
Burada, floresan etiketli hücreleri optik takas ve görüntüleme ile sabit yarı kalın fare beyin kesitleri görselleştirmek için oldukça hızlı ve basit bir yöntem mevcut. Ekli protokol yöntemlerini açıklar: 1) intrakardiyak perfüzyon, 2) diseksiyon ve tüm beyin kaldırılması, 3) agaroz, 4 sabit beyin gömme), yeni bir vibratome alet kullanarak hassas yarı kalın dilim hazırlama ile yerinde tespit beyin dokusu gliserol degrade üzerinden, 5) takas beyin dokusu, ve 6), ışık mikroskobu ve z-yığın yeniden yapılanma (Şekil 1) cam slaytlar montaj .
Beyin kesitleri hazırlamak için, nispeten yeni bir enstrümantasyon parça olarak adlandırılan 'Compresstome VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html) uygulanmaktadır. Bu cihaz, diğer vibratomes fonksiyonu benzer özelliklere sahip bir motorlu avans ve bıçak titreşim sistemi ile donatılmış bir yarı-otomatik mikrotom. Diğer vibratomes aksine, dilimlenmiş doku, paslanmaz çelik silindir içinde bir agaroz fiş monte edilir. İstediğiniz silindir arasında kalınlıklarda doku ekstrüde ve ileriye doğru ilerleyen titreşimli bıçak ile kesilir. Agaroz fiş / silindir sistemi tekrarlanabilir doku, montaj, hizalama ve hassas kesim sağlar. Bizim ellerde, 'Compresstome' verim için yüksek kaliteli doku elektrofizyoloji, immünhistokimya dilimleri, ve doğrudan sabit doku montaj ve görüntüleme. Optik temizleme birlikte, burada, yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme için yarı kalın sabit beyin dilim hazırlık göstermektedir.
Protocol
1 in situ beyin fiksasyon
* Fosfat ile dolu bir 10 ml şırınga (28 gauge iğne) hazırlayın tamponlu salin (PBS).
* PBS içinde% 4 paraformaldehid (PFA) ile dolu bir 10 ml şırınga (28 gauge iğne) hazırlayın. PFA / PBS Rezerv post fiksasyon için ek bir 5-10 ml.
- Avertin veya Nembutal öldürücü bir doz ile deneysel fare intraperitoneal enjekte edilir.
- Fare sedasyon sonra, etanol ile karın ıslak ve mantar, mum, ya da silikon elastomer diseksiyonu pimleri kullanarak katmanlı bir tepsi dibine fare güvenli. Yukarı bakacak şekilde karnın yüzeye dört pençeleri güvenli - mümkün olduğu kadar geniş yayılıyor.
- Sternum düzeyinde forseps ile cilt tut ve karaciğer maruz çaprazlama kesmek. Kaburga ve diyafram ile yanal ve ardından Kes. Göğüs dokusu kapağını çıkarın ve kalp erişilebilir kadar kesme devam ediyor.
- Pierce ya da makasla kesme, dolaşan kan akıtmak için sağ atriyuma.
- Artık kan dolaşım sistemi, sol ventrikül ile PBS perfüzyon ile yıkayın.
- Aynı iğne deliği erişme, sol ventrikül ile PBS / PFA sonraki perfüzyon tüm fare düzeltin.
2. Diseksiyon ve beyin çıkarımı
- Cilt, baş, boyun, ve kafatası kafatası açığa anteriora çekerek cilt, kulak kanalı ve göz yörüngeleri etrafında keserek çıkarın.
*) 2.5 adımları 2.2) bir örneği için Bkz: Şekil 2 - Kemik makası kullanarak, göz burun konka kemikler yoluyla soket çapraz olarak kesilmiş. Her iki tarafı için bunu yapın. Kertik gözleri ve koku ampuller önünde olmalıdır.
- Göz çukurlarının her kulak kanalının uzunlamasına kesin.
- Küçük bir diseksiyon makas kullanarak, diğer bir kulak kanalına beyincik üzerinde oksipital kemik plaka kesti.
- Aynı diseksiyon makas ile koku ampuller düzeyi orta hat boyunca anteriora kesti.
- Forseps kullanarak, herhangi bir bağ dokusu, kemik kaldırırken beyin bozulmadan kalır, böylece kaldırmak için özen, beynin her kemik plaka kaldırmak.
- Kırpılmış optik ve kranial sinirler, kesim, üst servikal vertebra ve fiksatif içine beyin kaldırmak.
- 4 1-2 saat Post-fix ° C Yıkama 3 kez 15 dakika PBS içinde.
3. Agaroz gömme
- Eritin% 2 yüksek mukavemetli, düşük-jel noktası agaroz tip IB (Sigma katalog numarası: A0576), mikrodalga fırın ile PBS salin.
- Erimiş agaroz bir test tüpüne aktarın. Sıcaklık dengeleme kadar sıcak bir inkübatör veya su banyosu (40 ° -41 ° C) test tüpü yerleştirin.
- Tutkal siyanoakrilat yapıştırıcı (Şekil 3A) ile örnek şırınga pistonu üzerine sabit beyin dokusu. Agaroz halka beyin dilimleri sonraki sürümü kolaylaştırmak için doymuş sakaroz-PBS çözüm beyin doku yüzeyine ince bir tabaka fırçalayın.
- Piston konut (Şekil 3B) beyin dokusu ile piston aşağı çizin.
- Pipet veya beyin doku kaplama, sıcak agaroz piston konut içine dökün. Agaroz içine hava kabarcıkları yakalama kaçının. Hava kabarcıkları agaroz dilim kalitesini tehlikeye sokacaktır.
- Soğuk (0 ° -25 ° C) 1 dakika için agaroz (Şekil 3C) ayarlamak için soğutma bloğu ile örnek şırıngayı Kelepçe
4. Compresstome beyin dilim Kesit
- Compresstome (Şekil 3B) beyin dokusu içeren numune şırınga birleştirin.
- Örnek şırınga çıkış (Şekil 3E) ile yakından jilet kenarına hizalayın.
- PBS solüsyonu ile tampon tankı doldurun.
- Numune şırınga agaroz-beyin doku bloğu a'ya için mikrometre bir kesit kalınlığı öne döndürün.
- Compresstome kontrol ünitesi kesit işlemini başlatmak için "start" butonuna basın.
- İstenen dilim kalınlığını belirlemek elde edinceye kadar tekrarlayın adımları 4.4) 4.5).
- PBS (Şekil 3F) ile dolu şişeleri veya boyama kuyu fırça veya pipet ile Hasat beyin dilimleri.
5. Optik Takas
- Gliserol vol çözüm: PBS% 75 vol hazırlayın.
- (Ya da pipet), toplanan beyin dilimleri PBS yıkama yarım hacmi kapalı dökün.
- Gliserol / PBS ile temizlenebilir hacmi geri ekleyin.
- 4 nazik karıştırma gelmesini sağlayınız ° C dilimleri lavaboya kadar.
- Son bir gliserol konsantrasyonu% 75 ulaşıncaya kadar) 6.4 adımları 6.2) tekrarlayın.
- PBS içinde% 90 gliserol ile çözüm değiştirin ve gelmesini sağlayınız.
* Not: gliserol çözümler eklerken hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. Hava kabarcıkları üniforma equilibra engel olacak bu yana, yavaş yavaş çözümler dökün ve hafifçe karıştırınkurulum ve montaj slayt üzerinde yapılacaktır.
6. Dilim görüntüleme için montaj
- Mikro slayt (SuperFrost Plus, 25 görüntülenebilir alana sığması için açık bir dikdörtgen içine çift taraflı conta yapıştırıcı (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) kesin X 75 X 1 mm, kedi # 48.311-703, VWR ) kenarları 2-3 mm genişliğinde.
- Merkezi bir pipet veya fırça kullanarak yapışkan bant dikdörtgenin içinde beyin dilimleri yerleştirin. Nazik aspirasyon ile aşırı gliserol çıkarın.
- Bir fırça ile istenilen sırayla slayt beyin dilimleri yerleştirin.
- Yapışkan bant üzerine yavaşça alt kapak cam (24 X 60 mm, kedi # 48.383-139, VWR), hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. Yapışkan bant ile temas sağlamak için cam kapak üzerine hafifçe basınç uygulayın.
- Slayt ve coverglass arasındaki kenarlarından fazla gliserol aspire.
- Seal net oje kullanarak slayt ve kapak.
- Görüntüleme önce kuru, ya da 4 slayt kutular içinde uzun vadeli saklamak için izin ver ° C.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
İşleme, görüntüleme ve floresan etiketli beyin dokusu analiz nörobiyoloji çalışma için vazgeçilmez hale gelmiştir. Bu araştırmaların çoğu gelişmiş genetik manipülasyonlar hem de düşük ve yüksek çözünürlüklü görüntü analizi ile hedeflenen nöronal altkümelerini muhabir ifade elde etmek için gerekir. Genellikle deneysel ve teknik sınırlamalar aynı hayvan imkansız bu tür verileri elde etmek için, ya da hızlı bir şekilde olun. Bu meydan okumanın içinde floresan görüntüleme yardımlar için optik-temizlenir, yarı kalın beyin bölümlerinin hazırlanması. , Genetiği değiştirilmiş kuduz virüsü ile etiketlenmiş sağlam kalın bir beyin dilim bir örneği ifade EGFP mühendisliği ve epifluorescent ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülü Şekil 4'te gösterilmiştir ve sırasıyla Şekil 5 . Epifluorescent görüntüleme için bir Leica M205 FA ve konfokal görüntü alımı için Zeiss LSM 510 kullanılmaktadır. Ekli protokol göreli basitliği nedeniyle, bu yöntem, bir gün daha az bir geri dönüş süresi ile floresan gazetecilere ifade doku yararlı görüntü verilerini verimli yeteneğine sahip, hem de düşük ve yüksek çözünürlüklü ışık mikroskobu ile uyumlu.
Araştırmacı ek postmortem etiketleme yöntemleri, immünohistokimyasal boyama, birleştirmek ya da ince bölümleri seçerse, protokol, buna göre uzar. Ancak, yukarıda açıklanan yöntem bozulmamış beyin hayati muhabir ifade tarama modelleri için basit ve nispeten yüksek verimli bir yöntem temsil eder.
Şekil 1: Akış şeması diagraming fiksasyon, diseksiyon, dilimleme, takas, ve yarı kalın beyin dilim montaj prosedürü.
Şekil 2 sıralı kesme adımları sağlam fare beyin ayıklamak için Diyagramı.
Şekil 3, beyin dokusu Compresstome kullanarak monte ve dilim Adımlar . A) beyin dokusu superglue kullanarak piston kesme üzerine yerleştirilmesi. B) agaroz gömmek için piston içine monte beyin dokusu aşağı çizimi. C) soğutulmuş bir sıkıştırma bloğu kullanarak bir agaroz beyin fiş katılaşabilme. D) Compresstome kesme odasına agaroz beyin tak ve piston Ekleme. Piston cihaza jilet E) Hizalama. F) Compresstome tampon odasına beyin dilimleri Kesme ve toplama.
Şekil 4 gliserol-temizlenir beyin dokusu gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ifade frontal korteks ile kalın bir dilim Işık mikroskobu görüntüleri. Bir fare beyin aracılığıyla A) Koronal dilim (200 um kalınlığında) bir viral vektör ifade EGFP etiketli ve düşük çözünürlükte bir epifluorescent Stereoskop kullanarak görüntülü. Ölçeği bar, 2 mm.
Şekil 5 floresan etiketli katmanı 5 / 6, temizlenmiş kalın bir beyin dilim kortikal nöronların yüksek büyütme görüntü. Z-yığını (150 um kalınlığında) vurgulanan bölgesi (Şekil 4) ile maksimum projeksiyon A) Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntü. Ölçeği bar, 25 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
, Işık mikroskobu, ekran, resim ve bozulmamış beyin dokusu içinde yapay sinir ağları analiz hızla vazgeçilmez bir araç olmuştur ihtiyacı üzerinden soruşturma nöronal alt kümelerini hedef floresan proteinleri kullanarak yaygın bir uygulama göz önüne alındığında.
, Kullanıcı dostu, in vivo elektroporasyon teknikleri viral vektörlerin, genetiği değiştirilmiş fare suşlarının gelişimi teknik gelişmeler artık araştırmak için etiketli hücre tiplerinin görünüşte sınırsız bir kaynak sağlar. Ancak, sağlam beyin dokusu görüntü analizi hala deney için bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Burada anlatılan yöntemi, floresan gazetecilere ifade beyin dokusu rutin analiz için son derece değerli olduğu kanıtlanmıştır. Bu, beynin bölümleri doku hazırlamak ve analiz etmek için gereken zaman önemli ölçüde keser, düşük güç tüketimi ve yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme ile uyumlu immünhistokimya ile birlikte kullanılabilir, diğer deneysel hayvan modellerinde çevrilebilir ve önemlisi, genel olarak multiphoton görüntüleme donanımları erişimi olmayabilir rutin laboratuar ortamları için geçerli. Ancak dikkat etmek önemlidir, gliserol ve diğer sulu ve organik çözümler ile bu optik temizleme pratik sınırlamaları vardır. Burada 200 um kalınlığında beyin dilimleri temizlenmesi kadar yardım etmek için gliserol kullanımını tanımlamak. 200 um dokularda görüntüleme çözünürlüğü artırmak için bu yöntem oldukça iyi çalışmasına rağmen, bunun ötesinde bir iyileşme görmüyorum. Diğer organik çözücüler, daha fazla doku temizleme yeteneğine sahiptir, ancak ticari bir floresan sinyal kaybı (ya da çıkarma) ile her zaman kapalı olduğundan.
FP floresan, otomatik dilimleme ve seri görüntüleme ile uyumlu diğer sulu veya organik faz çözücüler ile takas ya da daha kalın bir beyin dilimleri görüntüleme sağlamak için multi-foton micropscopy eşleştirme, yukarıda açıklanan yöntem olası varyasyonları perstaltic pompaları kullanarak perfüzyon içerebilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jian-Qiang Kong Bu makalede kullanılan bir ürün üretmektedir Precisionary Instruments, Inc, bir çalışanı.
Acknowledgments
Bu çalışma McNair Vakfı, NARSAD ve R00NS064171-03 NINDS hibe yoluyla destek tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma-Aldrich | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR international | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR international | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | -or equivalent |
References
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
