Summary
כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.
Abstract
המטרה הבסיסית הן המוח בסיסי וקליני היא להבין טוב יותר את זהויות, איפור מולקולרית, ודפוסי קישוריות האופייניים הנוירונים במוח שניהם בריאים וחולים. לקראת זה, במידה רבה של מאמץ הושם על מבנה ברזולוציה גבוהה מפות neuroanatomical 1-3. עם ההתרחבות של גנטיקה מולקולרית ההתקדמות במיקרוסקופ אור הגיע היכולת השאילתה לא רק מורפולוגיות העצבית, אלא גם את האיפור מולקולרית תאית של נוירונים בודדים ורשתות הקשורים בהם 4. התקדמות גדולה ביכולת לסמן ולטפל הנוירונים באמצעות טכנולוגיות המיקוד ואת מהונדס גנטי מכרסם כעת לאפשר לחוקרים תת נוירונים "התוכנית כרצונו 5-6. ניתן לטעון, אחת התרומות המשפיעים ביותר על בני זמננו מדעי המוח כבר גילוי שיבוט של הגנים המקודדים חלבונים ניאון (fps) ב 7-8 חוליות ימיים, לצד הנדסת הבאים שלהם תשואה הכלים המתרחבת של כתבים חיוני 9. ניצול הספציפיים לסוג תא מקדם פעילות לנהוג ממוקד ביטוי FP באוכלוסיות עצביות נפרדות עכשיו מאפשר חקירה neuroanatomical בדייקנות גנטית.
הנדסה ביטוי FP בנוירונים השתפר בהרבה להבנת מבנה המוח ותפקודו. עם זאת, הדמיה נוירונים בודדים ורשתות הקשורים בהם ברקמות המוח עמוק, או בשלושה ממדים, נשאר אתגר. בשל תוכן שומנים גבוהה, רקמת העצבים היא אטומה ולא ותערוכות פלואורסצנציה אוטומטי. מאפיינים אלה biophysical הטמון להקשות לדמיין ותמונה נוירונים שכותרתו fluorescently ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent או confocal תקן מעבר מעמקי עשרות מיקרונים. כדי לעקוף את זה לעתים קרובות החוקרים אתגר להעסיק הדמיה סדרתי סעיף דק שיטות השחזור 10, או 2-פוטון מיקרוסקופית סריקת לייזר 11. חסרונות הנוכחית כדי גישות אלו הם הכנה הקשורים עתירי עבודה רקמות, או עלות אוסרני מכשור בהתאמה.
כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ופשוטה יחסית לדמיין תאים שכותרתו fluorescently ב קבוע למחצה עבה פרוסות המוח עכבר ידי ניקוי הדמיה אופטית. בפרוטוקול המצורף אנו מתארים את שיטות: 1) תיקון רקמת המוח באתרו דרך זלוף intracardial, 2) דיסקציה והסרה של המוח כולו, 3) הטבעה המוח נייח agarose, 4) חצי פרוסה עבה דיוק הכנה באמצעות מכשור חדש vibratome , 5) המוח ניקוי רקמות באמצעות צבע גליצרול, ו 6) גובר על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ אור Z-מחסנית שחזור (איור 1).
להכנת פרוסות המוח יישמנו יצירה חדשה יחסית של מכשור בשם "Compresstome" VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). מכשיר זה הוא microtome חצי אוטומטיות מצויד מראש ממונע ותנודות מערכת להב עם תכונות דומות פונקציה vibratomes אחרים. בניגוד vibratomes אחרות, רקמת להיות פרוס מותקן בתקע agarose בתוך גליל נירוסטה. הרקמה הנמתח על עובי הרצוי מתוך גליל, וחותכים ידי להב רוטט קדימה לקידום. התוספת agarose / מערכת גליל מאפשר לשחזור רקמות הרכבה, יישור, חיתוך מדויק. בידיים שלנו, "Compresstome" תשואות גבוהות רקמות איכות פרוסות עבור electrophysiology, אימונוהיסטוכימיה, ישיר רקמה קבועה הרכבה והדמיה. בשילוב עם ניקוי אופטית, כאן אנחנו מדגימים הכנת למחצה עבה פרוסות המוח קבוע עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ניאון.
Protocol
1. קיבעון במוח באתרו
* היכונו מזרק 10 מ"ל (28 מחט מד) מלא שנאגרו מלוחים פוספט (PBS).
* היכונו מזרק 10 מ"ל (28 מחט מד) מלא paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS. שמורת 5-10 מ"ל נוספים של PFA / PBS עבור קיבעון הודעה.
- הזרק intraperitoneally עכבר ניסיוני עם מינון קטלני של Avertin או נמבוטל.
- לאחר עכבר מסומם, להרטיב את הבטן עם אתנול לאבטח את העכבר לתחתית מגש שכבתית עם פקק, שעווה, או אלסטומר סיליקון באמצעות סיכות לנתיחה. עם הבטן כלפי מעלה, להבטיח את ארבע כפות רגליים אל פני השטח - להפיץ אותם רחב ככל האפשר.
- תפוס את העור עם מלקחיים ברמה של עצם החזה, חתך לרוחב כדי לחשוף את הכבד. גזור רוחבית ואז דרך הצלעות והסרעפת. הסר את יריעת רקמה הצלעות וממשיכים חיתוך עד הלב נגיש.
- פירס או לגזור אטריום הזכות ניקוז הדם שהופץ.
- פלאש דם שיורית ממערכת הדם על ידי טפטוף של PBS דרך החדר השמאלי.
- גישה חור מחט אותו, לתקן את העכבר על ידי כל זלוף הבאות של PBS / PFA דרך החדר השמאלי.
2. Dissection והוצאה המוח
- הסר את העור מן הראש, הצוואר, הגולגולת על ידי חיתוך סביב תעלת האוזן ואת העין מסלולים, ואחריו מושך עור anteriorly לחשוף את הגולגולת.
* ראה איור 2 להמחשה צעדים 2.2) ל 2.5) - בעזרת מספריים העצם, חתך לרוחב מהעין דרך שקע חלזוני עצמות האף. האם זה עבור כל צד. במסור צריך להיות הקדמי של העיניים נורות חוש הריח.
- חותכים לאורכם של תעלת האוזן כל לשקע העין.
- בעזרת מספריים לנתיחה קטן, לחתוך את צלחת עצם העורף שכיסה את המוח הקטן של תעלת אוזן אחת לשנייה.
- עם מספריים לנתיחה אותו, לחתוך anteriorly לאורך קו האמצע לרמה של הנורות חוש הריח.
- בעזרת מלקחיים, להסיר כל צלחת עצם מהמוח, מקפיד להסיר את כל רקמת החיבור כך המוח נשאר שלם כאשר מרימים את העצם.
- עצבים Snip אופטיים גולגולתי, לחתוך את חוליות הצוואר העליון, ולהסיר את המוח לתוך מקבע.
- לאחר תיקון 1-2 שעות ב 4 ° C. לשטוף 3 פעמים 15 דקות כל אחד PBS.
3. Agarose הטבעה
- ממיסים 2% חוזק גבוה, נמוך ג'ל נקודת agarose סוג IB (מספר קטלוג סיגמא: A0576) ב-PBS מלוחים עם מיקרוגל.
- העברת agarose מותך אל מבחנה. מבחן מקום צינור באמבטיה חממה או מים חמים (40 ° -41 ° C) עד איזון הטמפרטורה.
- דבק רקמות מוח קבוע על הבוכנה של מזרק את הדגימה עם דבק cyanoacrylate (איור 3A). מברשת שכבה דקה של פתרון סוכרוז-PBS רווי על פני השטח של רקמת המוח כדי להקל על שחרור מאוחר של הטבעת agarose מן פרוסות המוח.
- צייר את הבוכנה עם רקמת המוח לתוך דיור על הבוכנה (איור 3B).
- פיפטה או לשפוך agarose חם לתוך דיור על הבוכנה, מכסה את רקמת המוח. הימנע השמנה בועות אוויר לתוך agarose. בועות האוויר agarose תתפשר על איכות פרוסה.
- הצמד את המזרק עם הדגימה (0 ° ל -25 ° C) קר לחסום מצמרר דקה 1 כדי להגדיר את agarose (איור 3 ג).
4. חתך פרוסה המוח עם Compresstome
- להרכיב את המזרק הדגימה המכיל את רקמת המוח לתוך Compresstome (איור 3D).
- יישר את קצה של סכין הגילוח הדוק עם היציאה של מזרק את הדגימה (איור 3E).
- ממלאים את המכל חיץ עם פתרון PBS.
- סיבוב אחד מיקרומטר עובי פרוסת קדימה כדי לחסום extrude-agarose רקמת המוח מתוך מזרק את הדגימה.
- לחצו על כפתור "התחל" על יחידת הבקרה של Compresstome כדי ליזום את תהליך חתך.
- חזור על שלבים 4.4) ל 4.5) עד פרוסות הרצוי מתקבלים לקבוע עובי.
- המוח קציר פרוסות עם מברשת או פיפטה כדי צלוחיות או בארות מכתים מלא PBS (איור 3F).
5. אופטי מסלקת
- הכן כרך 75%: פתרון כרך של גליצרול: PBS.
- יוצקים (או פיפטה) את נפח מחצית PBS לשטוף מן פרוסות המוח שנאספו.
- הוסף האחורי נפח הסיר עם גליצרול / PBS.
- אפשר לאזן עם ערבוב עדין על 4 מעלות צלזיוס עד כיור הפרוסות.
- חזור על שלבים 6.2) ל 6.4) עד ריכוז גליצרול הסופי מגיע 75%.
- החלף פתרון עם גליצרול 90% ב-PBS ולאפשר לאזן.
* הערה: הקפד לא להכניס בועות אוויר תוך הוספת פתרונות גליצרול. יוצקים פתרונות לאט ומערבבים בעדינות, מאז בועות אוויר יפריע אחיד equilibration ו יבוצעו על להחליק גובר.
6. פורסים הרכבה הדמיה
- גזור פעמיים צדדית דבק חותם (SA-S-1L, גרייס Bio-Labs) למלבן פתוח כדי להתאים את סביבות לצפייה של שקופית מיקרו (Superfrost בנוסף, 25 X 75 X 1, חתול מ"מ. # 48311-703, VWR ) עם הצדדים 2-3 מ"מ רוחב.
- מניחים פרוסות המוח בתוך במרכז המלבן דבק בעזרת פיפטה או מכחול. הסרה של עודפי גליצרול עם שאיפה עדינה.
- מסדרים פרוסות המוח בשקופית כדי הרצויה עם מכחול.
- זכוכית לכסות בעדינות נמוך יותר (24 X 60 מ"מ, חתול. # 48383-139, VWR) על גבי קלטת דבק, נזהרת שלא להכניס בועות אוויר. בעדינות להפעיל לחץ על מכסה זכוכית, כדי להבטיח מגע עם דבק.
- לשאוב גליצרול עודף קצוות בין שקופיות coverglass.
- חותם שקופיות coverslip באמצעות לק ברור.
- ייבוש לפני הדמיה, או לאחסן לטווח ארוך בקופסאות שקופיות ב 4 ° C.
7. נציג תוצאות:
עיבוד, הדמיה וניתוח של רקמת המוח שכותרתו fluorescently הפכו הכרחי ללמוד את לנוירוביולוגיה. רבים של חקירות אלה מחייבים מניפולציות גנטיות מתוחכמות כדי להשיג ביטוי הכתב תת עצבי ממוקד, ואחריו שני ניתוחים התמונה נמוכה ברזולוציה גבוהה. לעתים קרובות מגבלות הניסוי הטכני לעשות את זה אי אפשר להשיג סוגים אלה של נתונים חיים זהה, או בצורה מהירה. הכנת אופטית, ניקה, חצי עבה חלקים במוח פלורסנט הדמיה מסייע האתגר הזה. דוגמה פרוסה עבה מוח שלם שכותרתו עם וירוס הכלבת מהונדסים גנטית שהונדסו EGFP, הדמיה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent ו confocal מוצג באיור 4 ואיור 5 בהתאמה. עבור הדמיה epifluorescent השתמשנו M205 Leica FA, ועל רכישת התמונה confocal השתמשנו LSM Zeiss 510. בשל הפשטות היחסית של בפרוטוקול המצורף, שיטה זו הוא מסוגל מניב נתוני התמונה שימושי מרקמות להביע כתבים ניאון עם זמן אספקה של היום פחות, והוא תואם עם שניהם במיקרוסקופ אור נמוכה ברזולוציה גבוהה.
אם החוקר בוחר לשלב שיטות נוספות תיוג שלאחר המוות, מכתים immunohistochemical, או להפוך חלקים רזה, פרוטוקול מתארך בהתאם. עם זאת, בשיטה המתוארת לעיל מייצג שיטה פשוטה יחסית תפוקה גבוהה עבור דפוסי הקרנת הביטוי העיתונאי חיוניים במוח שלם.
באיור 1. תרשים זרימה diagraming את הקיבעון, ביתור, חיתוך, ניקוי, וההליך הרכבה של חצי עבה פרוסות המוח.
איור 2. דיאגרמה של צעדים חיתוך רציפים כדי לחלץ את המוח עכבר ללא פגע.
איור 3. צעדים הר פרוסה רקמת המוח באמצעות Compresstome. א) המיקום של רקמת המוח על חיתוך הבוכנה באמצעות דבק מגע. ב) ציור מטה רקמת המוח רכוב לתוך הבוכנה להטבעת agarose. ג) לחיזוק תקע המוח agarose באמצעות בלוק דחיסה צונן. ד) החדרת תקע המוח agarose ו הבוכנה לתוך תא חיתוך Compresstome. E) המערך של סכיני הגילוח למכשיר הבוכנה. F) חיתוך אוסף של פרוסות המוח לתוך תא חיץ Compresstome.
איור 4. תמונות במיקרוסקופ אור פרוסה עבה של רקמות גליצרול פינו דרך קליפת המוח הקדמית להביע משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (EGFP). פרוסת) העטרה דרך המוח עכבר (200 אממ עבה) שכותרתו עם EGFP וקטור ויראלי להביע הדמיה ברזולוציה נמוכה באמצעות stereoscope epifluorescent. סרגל קנה מידה, 2 מ"מ.
איור 5. התמונה בהגדלה גבוהה של שכבת שכותרתו fluorescently 5 / 6 נוירונים בקליפת המוח של פרוסה עבה פינה במוח. א) רזולוציית תמונה גבוהה confocal של הקרנת מקסימום Z-מחסנית (150 אממ עבה) דרך האזור מסומן (איור 4). סרגל קנה מידה, 25 אממ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לאור יישום נרחב של חלבונים באמצעות פלורסנט למקד תת נוירונים לחקירה באמצעות מיקרוסקופ אור, הצורך במהירות המסך, תמונה, ולנתח רשתות עצביות בתוך רקמת המוח שלם הפך יסולא בפז.
ההתקדמות הטכנית בפיתוח ידידותי למשתמש וקטורים ויראליים, בטכניקות electroporation vivo, ועל זני עכבר מהונדסים גנטית עכשיו מספק מקור בלתי מוגבל לכאורה של סוגי תאים שכותרתו לחקור. עם זאת, ניתוח התמונה של רקמת מוח שלם עדיין צוואר בקבוק לניסויים. השיטה המתוארת כאן הוכיחה להיות יקר מאוד עבור ניתוח שגרתי של רקמת המוח שלנו לבטא את הכתבים ניאון. היא חותכת באופן משמעותי את הזמן הדרוש כדי להכין ולנתח רקמות ממקטעים המוח, התואמת צריכת חשמל נמוכה וגם ברזולוציה גבוהה דימות פלואורסצנטי, ניתן להשתמש בשילוב עם immunocytochemistry, הוא לתרגום אחרים בבעלי חיים ניסיוניים, וחשוב מכך, הוא רחב החלים על סביבות מעבדה שגרתית כי אין גישה לציוד הדמיה multiphoton. חשוב לציין עם זאת, כי ניקוי אופטי עם גליצרול בתמיסות מימיות אורגניות אחרות יש מגבלות מעשיות. כאן אנו מתארים את השימוש של גליצרול לסייע ניקוי של פרוסות המוח עד 200 אממ עבה. אמנם שיטה זו פועלת היטב על מנת לשפר את רזולוציית הדמיה ברקמות עד 200 אממ, אנחנו לא רואים שיפור מעבר לכך. ממיסים אורגניים אחרים מסוגלים ניקוי רקמות נוספות, אולם תמיד יש את הסחר עם אובדן (או ממוצא) אות ניאון.
וריאציות אפשריות של השיטה המתוארת לעיל עשוי לכלול זלוף באמצעות משאבות perstaltic, ניקוי עם אחרים ממיסים השלב מימית או אורגני התואמות FP פלואורסצנטי, הדמיה אוטומטית לחתוך סדרתי, או זיווג עם micropscopy רב פוטון לאפשר הדמיה פרוסות המוח ואפילו עבה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jian-Qiang קונג הוא עובד Precisionary מכשירים, Inc, המייצרת מוצר שימוש במאמר זה.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי תמיכה באמצעות קרן מקניר, NARSAD ו NINDS מענק R00NS064171-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma-Aldrich | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR international | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR international | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | -or equivalent |
References
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244, 1288-1292 (1989).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Gene fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
