Summary
Мы представляем новый подход к количественному наночастиц локализации в сосудистой от человека xenografted опухолей с использованием динамических, в режиме реального времени прижизненных изображений в модели птичьего эмбриона.
Abstract
Современные технологии для визуализации опухоли, такие, как УЗИ, МРТ, ПЭТ и КТ, не в состоянии уступить изображений высокого разрешения для оценки наночастиц в опухолях на микроскопическом уровне 1,2,3, подчеркивая полезность подходящую модель ксенотрансплантата , в которых проводить детальный анализ поглощения. Здесь мы используем высоким разрешением прижизненной визуализации для оценки наночастиц в опухоли человека ксенотрансплантаты в модифицированном, раковины менее куриного эмбриона модели. Модель куриный эмбрион особенно хорошо подходят для этих анализов в естественных условиях, поскольку он поддерживает рост опухолей человека, является относительно недорогим и не требует анестезии или хирургического вмешательства 4,5. Опухолевые клетки образуют полностью васкуляризированной ксенотрансплантаты в течение 7 дней, когда имплантируется в chorioallantoic мембраны (CAM) 6. В результате опухоли визуализируются с помощью неинвазивных в реальном времени с высоким разрешением изображения, которые могут быть сохранены в течение 72 часов с минимальным воздействием на любой хост или опухоли систем. Наночастицы с широким диапазоном размеров и составов вводить дистальнее опухоли могут быть визуализированы и количественно по мере их прохождения через кровь, вытекать из сосудов в ткань с вытекающей сосудистая опухоль, и накапливаются в опухоли. Мы описываем здесь анализ наночастиц основе вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), украшенная ближней инфракрасной флуоресцентные красители и / или полиэтиленгликоль полимеров (ПЭГ) 7, 8, 9,10,11. После внутривенного введения этих вирусных наночастиц быстро усвоены эндотелиальных клеток, что приводит к глобальной маркировки сосудистую как снаружи, так и внутри опухоли 7,12. PEGylation от вирусных наночастиц увеличивает их полувыведения, расширяет свое время в обращении, и в конечном итоге повышает их накопления в опухоли через повышенной проницаемости и удержания (ЭПР) эффект 7, 10,11. Скорость и степень накопления наночастиц в опухоли измеряется в течение долгого времени с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Этот метод дает метод как визуализировать и количественно наночастиц динамики в опухолях человека.
Protocol
1. Прививка от опухоли в CAM птичьего эмбриона
- Подготовка оболочки менее оплодотворенных эмбрионов куриных, как описано 8.
- На 9-й день эмбрионального развития, собрать микро-инжектор использованием 18-иглы подключены на 1 мл шприца. Вырезать 5-6 дюймов кусок Tygon трубки (1 / 32 "внутренний диаметр, 3 / 32" наружный диаметр, 1 / 32 "толщина стенки) и аккуратно вставьте скос иглы в трубку. Примерно 4-5 дюймов трубки должны простираются от кончика иглы (рис. 1а).
- Заполните шприц и трубку с клеточной суспензии. Затем вставьте иглу микроинъекции стекла в конце трубы и тщательно удалить пузырьки воздуха.
- Inject День 9 эмбрионов (рис. 1б) при вскрытии прицел с подсветкой с 10000-100000 раковые клетки в виде болюса в течение CAM (рис. 1в). Медленно вводить клетки и тщательно обеспечить, чтобы игла находится в правильном месте для клеток для формирования видимых болюсно в CAM. Клетки, которые капать на поверхность CAM можно чистить с помощью Kimwipe или других аппликатора.
- Вернуться эмбрионов увлажненный инкубаторе при температуре 38 ° С при влажности 60% и позволяет опухоли расти и vascularize (до 7 дней).
2. Подготовка наночастиц
- Для подготовки флуоресцентно меченных CPMV наночастиц для введения в куриный эмбрион, разбавленный вирусных наночастиц (синтезируется как в 8 в PBS, рН 7,4, до концентрации 100 мкг / мл смеси Vortex задолго до того, использование и центрифуги в течение одной минуты, чтобы удалить. агрегатов. ультразвука также может быть полезна в зависимости от конъюгатов и степени агрегации. Запасы флуоресцентно меченных CPMVs стабильны в течение не менее 1 года при условии хранения при 4 ° С в темноте. Проверьте запасы периодически, поставив пару капель на предметное стекло и проверка флуоресценции. просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) также может быть использован для определения того, частицы остались нетронутыми после сопряжения.
- Короче говоря, один микрограмм вирусных наночастиц (в конечном объеме 2 мкл) могут быть добавлены к медным покрытием сетки. Затем добавьте равный объем 2% уранилацетата в течение 1 минуты на электронном микроскопе (Philips EM 410).
3. Внутривенное введение флуоресцентно меченных вирусных наночастиц
- На 16 день, сборки микро-инжектор, как описано выше. Составление требуемого объема вирусных наночастиц через шланг в шприц (> 200 мкл). Осторожно удалите воздушные пузырьки. Вставьте иглу микроинъекции стекла в конце трубы. Убедитесь, что игла тех пор, и конические, насколько возможно (рис. 2а). Если игла слишком тупой, он не сможет проникнуть через эктодермы и не сможет проникнуть в судно. Если игла слишком острым, кончик рухнет, когда проникающая ткани.
- Внутривенно вводят по 100 мкл 1 мг / мл флуоресцеина декстрана (70000 МВт Да, Invitrogen) в опухоли эмбриона подшипников дистальнее нужный сайт для визуализации (рис. 3). Успешная катетеризация вены CAM видно по очистке крови в пути инъекции потока (рис. 2б). Оценка сосудистой утечки через 1 час после инъекции.
- Внутривенно вводят 50 мкл 1 мг / мл раствора CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) или пегилированного CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-ПЭГ-AF 647) в эмбрионы содержащие опухоли с сосудистой утечки дистальных от желаемого сайта быть визуализированы.
- Изображение опухоли сразу и каждый час после инъекции использованием Zeiss Ревизора Z1 прямой микроскоп оснащен диском Yokogawa спиннинг, Хамамацу ImagEM 9100-12 EM-CCD камерой.
4. В реальном времени прижизненной визуализации
- Чтобы собрать блок эмбриона изображений, нанесите тонкий слой вакуумной смазки по окружности изображений порта на нижней крышке устройства визуализации эмбриона, и соответствовать 18 мм стекло покровное на порт.
- Позиция эмбриона, что покровное будет охватывать требуемую область для работы с изображениями. Медленно опустите крышку, пока покровное просто вступает в контакт с эмбриона, а затем винтовой крышкой на единицу, чтобы удерживать его на месте (рис. 2).
- Добавить воды, нагретой до 37 ° С в блок визуализации эмбриона вне блюдо с эмбриона, а затем поместить весь блок на сцену вертикально конфокальной микроскопии с внутренней экологической камеры доведены до 37 ° C.
- Установите копи содержащие эмбриона под вращающийся диск конфокальной микроскопии флуоресценции (рис. 2е). Копи проведет эмбриона на месте и держать в поле зрения фиксированной во время захвата изображения, позволяющий как для трехмерных стеков Z и покадровой изображения, которые будут захвачены в плен. Мы приобретаем и анализа трехмерных покадровой изображения с помощью Перкин Элмер (ранее импровизация) Volocity пакет программного обеспечения (рис. 3а). Приобретать высоким разрешением трехмерные стопки опухоли и окружающих сосудистой визуализировать detaileг структурного анализа в определенных временных точках. Приобретать трехмерных стеков в основное время, указывает на карте подробные структурные изменения в сосудистую сеть опухоли. Изображение опухоли каждый час после инъекции.
- Количественного поглощения вирусных наночастиц рассчитать среднее Alexa Fluor (AF) 647 сигнала в отдельных регионах в опухоли или в строме (неопухолевой область) с использованием образа программного обеспечения, таких как количественный Volocity (Perkin Elmer). Опухоли стромы соотношение было рассчитывается путем деления средней AF 647 сигнал в опухоли на длине AF 647 сигналов в строму. Опухоль / стромы соотношение выше, чем 1 указывает, что наночастицы, рассматриваемых опухоли.
5. Представитель результаты:
В примере, описанном здесь, мы вводили HT-29 клетки рака толстой кишки в форме болюса примерно 1 мм размера в течение CAM дня 9 куриных эмбрионов (рис. 1b). После прививки, эмбрионы культивировали в течение 7 дней в увлажненном инкубаторе разрешить достаточный рост опухоли и васкуляризации (рис. 1в). Эмбрионы вводили внутривенно с низким молекулярным весом декстран для подтверждения васкуляризации опухоли и опухоли были визуализированы под Zeiss AxioExaminer Z1 прямой микроскоп (рис. 2г).
После внутривенного введения CPMV-AF 647 или CPMV-ПЭГ-AF 647 наночастиц (рис. 3а, б) высокого разрешения в режиме реального времени конфокальной микроскопии (рис. 2е) показало, что оба CPMV и CPMV-ПЭГ наночастицы быстро помечены всей сосудистой сети, но поглощение CPMV-ПЭГ на опухоль была примерно в 3 раза выше, чем CPMV после 12 часов (рис. 3а). Относительное поглощение наночастиц опухоли определяли с помощью анализа изображений программное обеспечение (Volocity от Perkin Elmer). Интересующие регионы были выбраны в пределах и за пределами опухоли (в стромальных ящиком) и средняя интенсивность флуоресценции каждого был определен. Данные выражается как опухоль / стромы отношение.
Рисунок 1. Микроинъекция опухолей в CAM от птичьего эмбриона. () Микроинъекции аппарат собирается из компонентов, как указано. (Б) Птичий эмбрионов на 9-й день готовы к засевают опухоли, когда CAM распространился, чтобы покрыть всю поверхность. (С) На 16-й день, опухоль вырастет до до 1 см в диаметре (пунктирная линия) и готов к инъекции наночастиц.
Рисунок 2. Инъекции наночастиц и прижизненной визуализации. Инъекция под рассечение микроскопа () кончик иглы microinjector готовы быть введен в вену CAM и (б) иглы microinjector вставляется в вену (указано стрелкой) и наночастиц вводят в кровоток (если смотреть в безналичном крови). (С) изображений единица, содержащая птичьего эмбриона с покровным сопряжены непосредственно с CAM. (Г) До наночастиц инъекции, васкуляризация опухоли оценивается с помощью прижизненного изображения после введения флуоресцеина декстран. (Е) изображений единица, содержащая эмбрион расположен на этапе вертикально конфокальной микроскопии в пределах температуры регулируемой набора корпуса до 37 ° C.
Рисунок 3. Прижизненное визуализации наночастиц в опухолях человека. Опухоли визуализируются 7 часов после инъекции () CPMV-AF647 и (б) CPMV-ПЭГ-AF647. г) Иссечение опухоли от птичьего эмбриона для последующего анализа.
Discussion
Chorioallantoic мембраны (CAM) от птичьего эмбриона полезной модели для оценки динамики и сосудистой фармакокинетику опухолей человека. Структура и положение CAM позволяет с высокой приобретение качество изображения и вмещает многих видов рака ксенотрансплантаты без инвазивных хирургических процедур. Более того, ксенотрансплантаты раковой опухоли имплантируются в chorioallantoic мембраны стать васкуляризированной в течение 7 дней, предлагая быстрый, недорогой и полуфабрикатов высокой пропускной средства для оценки накопления наночастиц в опухолевой ткани. Поскольку раковые ксенотрансплантаты имплантированы в CAM оболочки менее куриные эмбрионы были доступны для высокого разрешения оптики вертикально epifluorescence или конфокальной микроскопии, контекстная и временной информации о наночастиц в сосудистую сеть опухоли могут быть легко получены. Рак ксенотрансплантаты в этой модели, как правило, растут с боков через CAM, что приводит к опухоли, которые являются большими, оставаясь при этом менее 200 м в глубину. Это делает их особенно хорошо подходит для прижизненной визуализации потому что стандартные epifluorescence микроскопы могут эффективно проникать всю массу опухоли. В отличие от опухолей, имплантированных в любом поверхностными или ортотопической сайтов внутри мыши размножаются в трех измерениях, что делает ее трудно точно локализовать наночастиц глубоко внутри этих опухолей путем неинвазивных методов. Мы использовали эту модель для оценки поглощения квантовых точек, липосомы и наночастицы оксида железа в число человеческих ксенотрансплантаты опухоли, подчеркивает потенциал для этой модели, чтобы служить для в естественных условиях анализ широкого спектра наночастицы формулировки.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано CCSRI Грант № 700537 и CIHR Грант № 84535 на ЛЗЕ и NIH / NCI грант № CA120711-01A1 и 01A1-CA120711 на AZ. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами и руководящими принципами институциональной уходу и использованию животных комитета в Университете Калифорнии в Сан-Диего, уходу за животными и использование в Университете Западного Онтарио.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
- Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
- Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
- Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
- Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
- Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
- Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , Forthcoming (2010).
