Summary
我々は、鳥類の胚のモデルでは動的な、リアルタイム生体イメージングを用いたヒト異種移植腫瘍の血管系でのナノ粒子の局在を定量化する新しいアプローチを提示する。
Abstract
このような超音波、MRI、PETとCTのような腫瘍イメージング、、のための現在の技術は、適切な異種移植モデルの有用性を強調し、微視的なレベル1,2,3での腫瘍のナノ粒子の取り込みの評価のために高解像度の画像を得ることができない詳細な取り込みの分析を実行するインチここで、我々は、修正された、シェルのないニワトリ胚モデルにおけるヒト腫瘍異種移植片でのナノ粒子の取り込みを評価するために高解像度の生体内イメージングを使用してください。それはヒトの腫瘍の成長をサポートしているため、ニワトリ胚のモデルは、特にin vivoでの解析でこれらのために適している、比較的安価であり、麻酔や手術は4,5は必要ありません。漿尿膜（CAM）6に移植するときに腫瘍細胞は7日以内に完全に血管移植片を形成する。結果として得られる腫瘍は、ホストまたは腫瘍どちらのシステムにおいてもほとんど影響を与えずに最大72時間まで維持することができる非侵襲的リアルタイム、高分解能のイメージングにより可視化。腫瘍への遠位投与サイズと処方の広い範囲でのナノ粒子は可視化し、血流を介してそれらの流れのように定量化することができる、漏れやすい腫瘍血管から浸出し、腫瘍部位に蓄積する。ここでは、近赤外蛍光色素および/ またはポリエチレングリコールポリマー（PEG）7、8、9,10,11で飾らササゲモザイクウイルス由来のナノ粒子（CPMV）の分析について説明します。静脈内投与時には、これらのウイルス粒子が急速に外部の両方の血管系のグローバルなラベルで、腫瘍7,12内で、その結果、内皮細胞によって内在化されています。ウイルス粒子のPEG化は、それらの血漿中半減期を増加させ、循環で自分の時間を拡張し、最終的に強化された透過性と保持（EPR）効果7、10,11を介して腫瘍で、その蓄積を高める。腫瘍中のナノ粒子の蓄積の速度および程度は画像解析ソフトを用いて経時的に測定される。この手法は、ヒトの腫瘍にナノ粒子のダイナミクスを可視化し定量化するために、両方のメソッドを提供します。
Protocol
1。鳥類胚のCAMへの腫瘍の接種
- 8のようなシェルレス受精ニワトリ胚を準備します。
- 胚発生の9日目に、1 mLシリンジに接続して18ゲージ針を用いて、マイクロインジェクターを組み立てます。タイゴンチューブの5〜6インチピース（1 / 32"内径、3 / 32"外径、1 / 32"壁厚）をカットし、慎重にチューブに針のベベルを挿入する。チューブの約4〜5インチのはず針の先端（図1a）から延びる。
- 細胞懸濁液と注射器とチューブを埋める。その後、チューブの端にマイクロインジェクションのガラス針を挿入し、慎重に気泡を取り除く。
- CAM（図1c）内ボーラスとして10,000-100,000癌細胞とイルミで解剖の範囲で9日目胚（図1b）を注入する。徐々に細胞を注入し、慎重に針がCAM内に表示されるボーラスを形成する細胞の正しい場所にあることを確認してください。 CAMの表面にドリップをキムワイプまたは他のアプリケーターを用いて洗浄することができる細胞。
- 60％の湿度で38℃で加湿インキュベーターに胚を戻すと成長し、血管が発達する（最大7日間）に腫瘍ができます。
2。ナノ粒子の調製
- ニワトリ胚への注入のために蛍光標識CPMVのナノ粒子を準備するには、。いずれかを削除する1分間のために使用し、遠心前にウイルス粒子を（100μg/ mlの濃度に、PBS、pH7.4中8のように合成された渦混合物も希釈凝集体。音波処理も複合体および凝集の程度に応じて役に立つかもしれません。4℃で保存した場合、蛍光標識CPMVsの株式は、少なくとも1年間は安定である。·ダークのC。夫婦を入れて定期的に株式をチェックして、スライドガラスの上に落とし、蛍光。透過型電子顕微鏡（TEM）をチェックすると、粒子が抱合した後、そのまま残っているかどうかを判断するために使用することができます。
- 簡単に言うと、ウイルス粒子の1マイクログラムは、（2μlの最終容量で）銅被覆グリッドに追加することができます。次に、電子顕微鏡（フィリップスEM 410）で1分間、2％酢酸ウラニルの等量を追加します。
3。蛍光標識ウイルス粒子の静脈注射
- 16日目に、上記のように、マイクロインジェクターを組み立てます。注射器にチューブ（> 200μL）を介してウイルス粒子の所望の体積を描く。慎重に気泡を取り除く。チューブの端にマイクロインジェクション用ガラス針を挿入します。針が（図2a）できるだけ長くしてテーパー状になっていることを確認してください。針が非常に鈍い場合は、外胚葉を通して貫くことができなくなりますし、血管を貫通して失敗します。針が非常にシャープの場合は組織を貫通する際に、先端が収縮されます。
- 静脈内（図3D）可視化する目的のサイトから遠位の腫瘍を有する胚に1 mg / mlのフルオレセインデキストラン（MW7万ダ、Invitrogen社）の100μlを注入する。 CAMの静脈の成功カニューレは、インジェクションフローのパス内の血液のクリア（図2b）によって明らかである。注入後の血管の漏れ1時間を評価する。
- 静脈内に目的のサイトから遠位血管の漏れで腫瘍を含む胚には1mg / CPMV -のAlexa Fluor ® 647（CPMV - AF 647）やPEG化CPMV -のAlexa Fluor ® 647（CPMV - PEG - AF 647）mlの溶液50μlを注入する可視化すること。
- 画像の即座に腫瘍と横河電機回転ディスク、浜松ImagEM 9100〜12 EM - CCDカメラを装着したツァイス審査Z1正立顕微鏡を用いて注射後時間ごと。
4。リアルタイム生体イメージング
- 胚の撮像ユニットを組み立てるには、胚のイメージングユニットの蓋の下側の画像ポートの周囲に真空グリスの薄層を適用し、ポートに18 mmのガラスカバーを装着します。
- カバースリップは、イメージングのための必要なエリアをカバーするような胚を配置します。ゆっくりとカバースリップがちょうど胚に接触するまでふたを少し下げて、その後（図2c）の場所でそれを保持するためにユニットの上に蓋をねじ込む。
- ° C胚を含む皿の外胚の撮像ユニットに37に加熱水を追加し、その後、37に平衡内部環境室℃で直立共焦点顕微鏡のステージ上に全体のユニットを配置
- スピニングディスク共焦点蛍光顕微鏡（図2E）の下で胚を含む撮像ユニットを置きます。撮像ユニットは、キャプチャされる三次元Zスタックやタイムラプスイメージの両方を可能にする、場所に胚を保持して画像を取り込む際に固定されたビューのフィールドを保持します。我々は、パーキンエルマーの（旧即興）Volocityのソフトウェアパッケージを（図3a）を用いて3次元タイムラプス画像を取得し、分析する。腫瘍の三次元スタックの高解像度とdetaile可視化するために周囲の血管系を取得する特定の時間点でのD構造解析。腫瘍血管系の詳細な構造変化をマッピングするために定期的な時間の点で三次元スタックを取得する。画像の腫瘍注射後の時間ごと。
- 腫瘍や間質内の選択した領域内の平均値のAlexa Fluor（AF）647信号（非腫瘍領域）Volocity（パーキンエルマー）等の画像の定量ソフトウェアを用いて計算することにより、ウイルス粒子の取り込みを定量する。間質比は腫瘍は間質の平均AF 647信号を介して腫瘍の平均AF 647信号を割ることにより算出した。 1より高い腫瘍/間質比は、ナノ粒子が腫瘍によって占有されていることを示します。
5。代表的な結果：
この例ではここで説明する、私たちは9日目ニワトリ胚（図1b）のCAM内に大きさで1mm程度ボーラスを形成するために、HT - 29結腸癌細胞を注入した。接種後、胚は十分な腫瘍の増殖と血管新生（図1c）を許可する加湿インキュベーターで7日間培養した。胚は、腫瘍の血管新生を確認するために、低分子デキストランを静脈内注射した、と腫瘍はツァイスAxioExaminer Z1正立顕微鏡（図2d）で可視化した。
CPMV - AF 647またはCPMV - PEG - AF 647ナノ粒子（図3aとb）の静脈内投与後、高解像度のリアルタイム共焦点イメージング（図2eは）CPMVとCPMV - PEGは、ナノ粒子の両方が急激に全体の血管系のラベルが付いたことを明らかにしたが、腫瘍によるCPMV - PEGの取り込みは、12時間（図3a）の後CPMVより約3倍高かった。ナノ粒子の相対的な腫瘍の取り込み、画像解析ソフトウェアを（パーキンエルマーからVolocity）を用いて決定した。関心領域は、腫瘍内と外で選ばれた（間質コンパートメントにおける）とそれぞれの平均蛍光強度を測定した。データは、腫瘍/間質比として表現されます。
図1。鳥類の胚のCAMへの腫瘍のマイクロインジェクション。示されているように（a）にマイクロインジェクション装置は、コンポーネントから組み立てられます。 （B）9日目での鳥の胚では、CAMが表面全体を覆うように広がっているときに腫瘍を接種する準備が整いました。 （C）16日目では、腫瘍は直径1cm（破線）にまでに成長し、ナノ粒子を注射するための準備ができているでしょう。
図2ナノ粒子の注入と生体内イメージング。 CAMの静脈に注入するインジェクターの針の先端は準備ができて（）を示すと（b）マイクロインジェクターの針が静脈に挿入した（矢印）とクリアで見られる血流（に注入ナノ粒子解剖顕微鏡下で注入血液の）。 CAMとの直接インタフェースカバーと鳥類の胚を含む（C）イメージングユニット。 （D）ナノ粒子の注入に先立って、腫瘍の血管新生は、フルオレセインデキストランの投与後に生体内イメージングを用いて評価する。 （e）のイメージングユニットは37℃に温度調節エンクロージャのセット内で直立共焦点顕微鏡のステージ上に位置する胚を含む
図3。ヒト腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの生体内可視化。腫瘍は、（a）CPMV - AF647と（b）CPMV - PEG - AF647の注入後7時間を可視化している。その後の分析のための鳥類の胚から腫瘍のd）の切除。
Discussion
鳥類の胚の漿尿膜（CAM）は、ヒトの腫瘍の血管動態と薬物動態を評価するための有用なモデルです。 CAMモデルの構造と位置は、高品質の画像取得を可能にし、侵襲的な外科手術なしで癌異種移植片の多くの種類の対応。また、がんの腫瘍異種移植片は、腫瘍組織におけるナノ粒子の蓄積を評価するために、迅速、安価でセミハイスループットな手段を提供し、7日以内に血管が新生になる漿尿膜に移植。シェルレスニワトリ胚のCAMに移植された癌の異種移植片は、腫瘍血管系におけるナノ粒子の取り込みに関する直立落射蛍光または共焦点顕微鏡、文脈と時間情報の高分解能光学系にアクセスすることができるので容易に得ることができる。このモデルにおける癌の異種移植片は深さ未満が200メートルを維持しながら、大きい腫瘍で、その結果、CAMを介して横方向に成長する傾向がある。標準の落射蛍光顕微鏡は、効果的に腫瘍全体の質量を貫通することができるので、これは彼らが特に生体内イメージングに適しています。対照的に、マウスの中で表在性または同所のサイトのいずれかで移植された腫瘍は、それは難しい正確に非侵襲的手法によりこれらの腫瘍内の深いナノ粒子をローカライズすること、三次元的に増殖する。我々は、ナノ粒子製剤の広い範囲ののin vivo解析に適していることがこのモデルの可能性を強調し、ヒト腫瘍異種移植片の数で量子ドット、リポソーム、および酸化鉄ナノ粒子の取り込みを評価するためにこのモデルを利用してきた。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、アリゾナ州にJDLとNIH / NCIの助成金＃CA120711 - 01A1とCA120711 - 01A1にCCSRIグラント＃700537とCIHRグラント＃84535によってサポートされていました。全ての実験は、動物実験の規制やガイドラインに従って実施し、ウェスタンオンタリオ大学で、カリフォルニア大学サンディエゴ校の委員会、動物実験を使用していた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
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