Summary
Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.
Abstract
De huidige technieken voor beeldvorming van tumoren, zoals echografie, MRI, PET en CT, niet in staat zijn om hoge resolutie beelden leveren voor de beoordeling van nanodeeltjes opname in tumoren op microscopisch niveau 1,2,3, met de nadruk het nut van een geschikte xenograft model waarin om gedetailleerde opname analyses uit te voeren. Hier gebruiken we een hoge resolutie imaging intravitale aan nanodeeltjes opname te evalueren in menselijke tumoren xenotransplantaten in een gewijzigde, shell-less kippenembryo model. De kip embryo model is bijzonder geschikt voor deze in vivo analyses, want het ondersteunt de groei van menselijke tumoren, is relatief goedkoop en vereist geen verdoving of een operatie 4,5. Tumorcellen formulier volledig gevasculariseerd xenotransplantaten binnen 7 dagen wanneer geïmplanteerd in het chorion-membraan (CAM) 6. De resulterende tumoren worden gevisualiseerd door niet-invasieve real-time, hoge-resolutie beeldvorming die kan worden gehandhaafd tot 72 uur met weinig impact op zowel de host-of tumor-systemen. Nanodeeltjes met een breed scala van maten en formuleringen toegediend distaal van de tumor kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd als ze door de bloedbaan, extravasaat van lekkende tumorvasculatuur, en zich ophopen op de tumor site. We beschrijven hier de analyse van nanodeeltjes afgeleid van Cowpea mosaic virus (CPMV) versierd met nabij-infrarood fluorescerende kleurstoffen en / of polyethyleen glycol polymeren (PEG) 7, 8, 9,10,11. Bij intraveneuze toediening, zijn deze virale nanodeeltjes snel geïnternaliseerd door endotheelcellen, wat resulteert in de wereldwijde etikettering van het vaatstelsel zowel buiten als binnen de tumor 7,12. PEGylering van de virale nanodeeltjes verhoogt hun plasma half-life, verlengt hun tijd in de circulatie, en uiteindelijk verbetert hun accumulatie in de tumoren via de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect 7, 10,11. De snelheid en mate van accumulatie van nanodeeltjes in een tumor wordt gemeten over de tijd met behulp van beeldanalyse-software. Deze techniek biedt een methode om zowel te visualiseren en te kwantificeren nanodeeltjes dynamiek in menselijke tumoren.
Protocol
1. Enten van tumor in de aviaire embryo CAM
- Bereid shell-minder bevruchte kippenembryo's, zoals beschreven 8.
- Op dag 9 van de embryonale ontwikkeling, monteren een micro-injector met behulp van een 18-gauge naald is aangesloten op 1 ml spuit. Snijd een 5-6 centimeter stuk Tygon slang (1 / 32 "inwendige diameter, 3 / 32" buitendiameter, 1 / 32 "wanddikte) en voorzichtig bevel van de naald in de slang. Ongeveer 4-5 cm van de slang moet uitstrekken van het uiteinde van de naald (figuur 1a).
- Vul de spuit en slang met een celsuspensie. Plaats vervolgens een micro-injectie glazen naald aan het uiteinde van de slang en verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen.
- Injecteer Dag 9 embryo's (Figuur 1b) onder een dissectie bereik met een lamp met 10.000-100.000 kankercellen als een bolus in de CAM (figuur 1c). Injecteer langzaam cellen en zorgvuldig ervoor te zorgen dat de naald op de juiste plaats voor de cellen om een zichtbare bolus vormen binnen de CAM. Cellen die druppelen op de CAM oppervlak kan worden schoongemaakt met Kimwipe of andere applicator.
- Keer terug naar embryo's bevochtigde incubator bij 38 ° C bij 60% luchtvochtigheid en laat tumor te groeien en vascularize (tot 7 dagen).
2. De voorbereiding van nanodeeltjes
- Om fluorescent gelabelde CPMV nanodeeltjes voor te bereiden voor injectie in het kippenembryo, verdunnen de virale nanodeeltjes (zoals gesynthetiseerd in 8 in PBS, pH 7,4, tot een concentratie van 100 ug / ml Vortex mengsel goed voor het gebruik en centrifugeer gedurende een minuut een te verwijderen. aggregaten. Ultrasoonbehandeling kan ook nuttig zijn, afhankelijk van conjugaten en de mate van aggregatie. Voorraden van de fluorescent gelabelde CPMVs stabiel zijn gedurende tenminste een jaar indien bewaard bij 4 ° C in het donker. Controleer regelmatig of voorraden door er een paar druppels op een glasplaatje en controleren op fluorescentie. Transmissie Elektronen Microscopie (TEM) kan ook gebruikt worden om te bepalen of de deeltjes bleef intact na conjugatie.
- Kortom, kan een microgram van virale nanodeeltjes (in een eindvolume van 2 pl) worden toegevoegd aan de koper beklede roosters. Voeg vervolgens een gelijk volume van 2% uranylacetaat gedurende 1 minuut bij elektronenmicroscoop (Philips EM 410).
3. Intraveneuze injectie van fluorescent gelabelde virale nanodeeltjes
- Op dag 16, assembleren micro-injector zoals hierboven beschreven. Het opstellen van gewenste volume van virale nanodeeltjes door middel van de slang in de spuit (> 200 pi). Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen. Steek micro-injectie glazen naald aan het uiteinde van de slang. Zorg ervoor dat de naald is zo lang en taps toelopende mogelijk (Figuur 2a). Als de naald is te bot, zal het niet kunnen doorboren via het ectoderm en zal niet aan het schip binnen te dringen. Als de naald is te scherp, zal de tip instorten bij het betreden van weefsel.
- Spuit 100 ul van 1 mg / ml fluoresceïne dextran (MW 70.000 Da, Invitrogen) in tumor dragende embryo distaal van de gewenste site te visualiseren (Figuur 3d). Succesvolle canulatie van CAM ader is duidelijk door het opruimen van bloed in het pad van de injectie debiet (Figuur 2b). Beoordeel vasculaire lek een uur na de injectie.
- Spuit 50 ul van 1 mg / ml oplossing van CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) of gepegyleerd CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) in de embryo's met tumoren met vasculaire lekkage distaal van de gewenste site aan gevisualiseerd worden.
- Afbeelding tumoren onmiddellijk en elk uur na het injecteren met behulp van een Zeiss examinator Z1 rechtop microscoop uitgerust met een Yokogawa draaiende schijf, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-camera.
4. Real-time beeldvorming intravitale
- Te monteren het embryo imaging unit, een dun laagje van vacuüm vet rond de omtrek van de imaging-poort aan de onderkant van het deksel van de embryo imaging unit, en passen een 18 mm glazen dekglaasje op de haven.
- Plaats de embryo zodanig dat de dekglaasje zal het gewenste gebied voor de beeldvorming te dekken. Langzaam de deksel totdat het dekglaasje net contact maakt met het embryo, en schroef het deksel op het apparaat om het te zijn plaats te houden (figuur 2c).
- Voeg het water verwarmd tot 37 ° C in het embryo beeldeenheid buiten het schaaltje met het embryo, en vervolgens de gehele eenheid plaats op het podium van een rechtopstaande confocale microscoop met de binnenkant klimaatkamer evenwicht tot 37 ° C.
- Plaats de beeldeenheid met de embryo onder de draaiende schijf confocale fluorescentie microscoop (figuur 2e). De beeldeenheid houdt het embryo in en houden het gezichtsveld vast tijdens het vastleggen van beelden, zodat voor zowel de drie-dimensionale Z stacks en time-lapse beelden worden vastgelegd. We verwerven en analyseren van drie-dimensionale time-lapse beelden met behulp van Perkin Elmer's (voorheen Improvisation) Volocity software pakket (figuur 3a). Acquire een hoge-resolutie driedimensionale stapel van de tumor en de omringende bloedvaten te visualiseren detailed structurele analyses op specifieke tijdstippen. Acquire driedimensionale schoorstenen op regelmatige tijdstippen om gedetailleerde structurele veranderingen in de tumorvasculatuur kaart. Afbeelding tumoren elk uur na de injectie.
- Kwantificeren de opname van virale nanodeeltjes door het berekenen van de gemiddelde Alexa Fluor (AF) 647 signaal binnen de geselecteerde gebieden in de tumor of in het stroma (niet-tumor gebied) met behulp van beeld kwantificatie software zoals Volocity (Perkin Elmer). De tumor stroma ratio berekend door de gemiddelde AF 647-signaal in de tumor meer dan de gemiddelde AF 647-signaal in het stroma. Een tumor / stroma-ratio hoger dan 1 geeft aan dat de nanodeeltjes wordt ingenomen door de tumor.
5. Representatieve resultaten:
In het voorbeeld hier beschreven, we geïnjecteerd HT-29 dikke darm kankercellen naar een bolus van ongeveer 1 mm in grootte vorm binnen de CAM van de dag 9 kippenembryo's (Figuur 1b). Na inoculatie werden de embryo's gekweekt voor 7 dagen in een vochtige incubator om voldoende groei van de tumor en de vascularisatie (figuur 1c) toe te staan. Embryo's werden intraveneus geïnjecteerd met een laag moleculair gewicht dextran aan tumor vascularisatie te bevestigen, en de tumoren werden gevisualiseerd onder de Zeiss AxioExaminer Z1 rechtop microscoop (figuur 2d).
Na intraveneuze toediening van CPMV-AF 647 of CPMV-PEG-AF 647 nanodeeltjes (Figuur 3a en b), hoge-resolutie real-time confocale imaging (figuur 2e) bleek dat zowel de CPMV en CPMV-PEG nanodeeltjes snel bestempeld als de gehele vaatstelsel, maar de opname van CPMV-PEG door de tumor was ongeveer drie keer hoger dan CPMV na 12 uur (figuur 3a). De relatieve tumor opname van nanodeeltjes werd bepaald met behulp van beeldanalyse-software (Volocity van Perkin Elmer). Regio's van belang zijn geselecteerd binnen en buiten de tumor (in de stromale compartiment) en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk werd bepaald. Worden uitgedrukt als tumor / stroma ratio.
Figuur 1. Micro-injectie van tumoren in de CAM van een aviaire embryo. (A) Het micro-injectie apparaat is samengesteld uit de onderdelen zoals aangegeven. (B) Aviaire embryo's op dag 9 zijn klaar om te worden ingeënt met tumor als de CAM heeft verspreid naar het gehele oppervlak te dekken. (C) Op dag 16, zal de tumor gegroeid tot maximaal 1 cm in diameter (stippellijn) en is klaar voor de injectie met nanodeeltjes.
Figuur 2. Nanodeeltje injectie en intravitale beeldvorming. Injectie onder een microscoop met dissectie (a) de tip van de naald microinjector klaar om te worden geïnjecteerd in de ader CAM en (b) de microinjector naald ingebracht in de ader (aangegeven met pijl) en nanodeeltjes geïnjecteerd in de bloedstroom (gezien door clearing van het bloed). (C) Imaging unit met aviaire embryo met het dekglaasje interface direct met de CAM. (D) Alvorens met nanodeeltjes injectie, is tumor vascularisatie beoordeeld aan de hand intravitale beeldvorming na injectie van fluoresceïne dextran. (E) Imaging eenheid waarin de embryo geplaatst op het toneel van een rechtopstaande confocale microscoop in een temperatuur-gereguleerde behuizing ingesteld op 37 ° C.
Figuur 3. Intravitale visualisatie van nanodeeltjes opname in de menselijke tumoren. Tumoren worden gevisualiseerd 7 uur na injectie van (een) CPMV-AF647 en (b) CPMV-PEG-AF647. d) Excisie van de tumor zijn van aviaire embryo voor verdere analyse.
Discussion
Het chorion-membraan (CAM) van het aviaire embryo is een bruikbaar model om de vasculaire dynamiek en farmacokinetiek van menselijke tumoren te beoordelen. De structuur en de positie van de CAM staat een hoge kwaliteit beeld acquisitie en is geschikt voor vele soorten kanker xenografts zonder invasieve chirurgische procedures. Bovendien, kanker tumor xenotransplantaten geïmplanteerd in het chorion membraan worden gevasculariseerd binnen 7 dagen en biedt een snelle, goedkope en semi-high-throughput middel om de ophoping van nanodeeltjes in tumorweefsel te beoordelen. Aangezien kanker xenotransplantaten geïmplanteerd in de CAM van shell-loze kippenembryo's zijn toegankelijk voor de hoge-resolutie optiek van een rechtopstaande epifluorescentie of confocale microscoop, contextuele en temporele informatie met betrekking tot nanodeeltjes opname in de tumorvasculatuur gemakkelijk kan worden verkregen. Kanker xenotransplantaties in dit model hebben de neiging om te groeien lateraal over de CAM, wat resulteert in tumoren die zijn groot, terwijl de resterende minder dan 200 m diepte. Dit maakt hen bijzonder goed geschikt voor intravitale beeldvorming, want standaard epifluorescentie microscopen effectief kan doordringen in de hele tumor massa. In tegenstelling, tumoren geïmplanteerd in ofwel oppervlakkig of orthotope sites binnen de muis vermenigvuldigen in drie dimensies, waardoor het moeilijk is om nauwkeurig te lokaliseren nanodeeltjes diep binnen deze tumoren door niet-invasieve technieken. Wij hebben dit model gebruikt om het gebruik van quantum dots, liposomen, en ijzeroxide nanodeeltjes in een aantal menselijke tumoren xenotransplantaten beoordelen, aandacht voor de mogelijkheden voor dit model geschikt te zijn voor de in vivo analyse van een breed scala aan nanodeeltjes formuleringen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door CCSRI Grant # 700537 en CIHR Grant # 84535 te JDL en NIH / NCI verlenen # CA120711-01A1-01A1 en CA120711 naar AZ. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regelgeving en richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Universiteit van Californië in San Diego, Dierverzorging en gebruiken aan de University of Western Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
- Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
- Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
- Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
- Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
- Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
- Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , Forthcoming (2010).
