Summary
Nous présentons une nouvelle approche pour quantifier la localisation des nanoparticules dans le système vasculaire des tumeurs humaines xénogreffées aide dynamique, imagerie en temps réel intravitale dans un modèle d'embryon aviaire.
Abstract
Les technologies actuelles d'imagerie des tumeurs, comme l'échographie, IRM, PET et CT, sont incapables de donner des images haute résolution pour l'évaluation de l'absorption des nanoparticules dans les tumeurs au niveau microscopique 1,2,3, soulignant l'utilité d'un modèle de xénogreffe adaptée dans lequel pour effectuer des analyses détaillées absorption. Ici, nous utilisons l'imagerie haute résolution intravitale pour évaluer l'absorption des nanoparticules dans les xénogreffes de tumeurs humaines dans une modification, le modèle d'embryon de poulet sans coquille. Le modèle d'embryons de poulet est particulièrement bien adaptée pour ces analyses in vivo, car elle soutient la croissance de tumeurs humaines, est relativement peu coûteux et ne nécessite pas une anesthésie ou une chirurgie 4,5. Les cellules tumorales forment totalement xénogreffes vascularisé dans les 7 jours lorsqu'ils sont implantés dans la membrane chorio (CAM) 6. Les tumeurs qui en résultent sont visualisés par imagerie non invasive en temps réel, haute résolution qui peut être maintenue jusqu'à 72 heures avec peu d'impact sur l'hôte ou des systèmes de tumeur. Les nanoparticules avec une large gamme de tailles et de formulations administrées à la tumeur distale peuvent être visualisées et quantifiées comme ils par la circulation sanguine, de la vascularisation tumorale s'extravaser qui fuient, et s'accumulent dans le site tumoral. Nous décrivons ici l'analyse de nanoparticules dérivées de virus de la mosaïque du niébé (CPMV) décoré avec le proche infrarouge colorants fluorescents et / ou polymères de polyéthylène glycol (PEG) 7, 8, 9,10,11. Après administration par voie intraveineuse, ces nanoparticules virales sont rapidement internalisées par les cellules endothéliales, entraînant l'étiquetage global de la vascularisation à l'extérieur et au sein de l'7,12 tumeur. PEGylation des nanoparticules virale augmente leur demi-vie plasmatique, s'étend de leur temps dans la circulation, et accroît leur accumulation dans les tumeurs via la perméabilité accrue et la rétention (EPR) Effet 7, 10,11. Le taux et l'étendue de l'accumulation de nanoparticules dans une tumeur est mesurée au cours du temps en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Cette technique fournit une méthode à la fois visualiser et de quantifier la dynamique des nanoparticules dans les tumeurs humaines.
Protocol
1. L'inoculation de la tumeur dans le CAM d'embryon aviaire
- Préparer sans coquille des embryons de poulet fécondés comme décrit 8.
- Le 9 ème jour de développement embryonnaire, assembler un micro-injecteur à l'aide d'une aiguille de calibre 18 connectés sur seringue de 1 mL. Coupez un morceau de tuyau 5-6 pouces Tygon (1 / 32 "de diamètre, 3 / 32" de diamètre extérieur, 1 / 32 "épaisseur de paroi) et insérer délicatement l'aiguille de biseau de dans le tube. Environ 4-5 cm de tubulure doit s'étendent de la pointe de l'aiguille (figure 1a).
- Remplir la seringue et le tube avec la suspension cellulaire. Ensuite, insérer une aiguille de verre micro-injection à l'extrémité du tube et enlever soigneusement les bulles d'air.
- Injecter Jour 9 embryons (figure 1b) sous un champ de dissection d'un illuminateur d'10,000-100,000 cellules cancéreuses en bolus dans le CAM (figure 1c). Lentement injecter des cellules et soigneusement s'assurer que l'aiguille est dans le bon endroit pour les cellules de former un bol visibles au sein de la CAM. Les cellules qui dégoutte sur la surface de came peuvent être nettoyés en utilisant l'applicateur Kimwipe ou autres.
- Retour aux embryons incubateur humidifié à 38 ° C avec une humidité de 60% et permettre la tumeur de croître et vasculariser (jusqu'à 7 jours).
2. Préparation de nanoparticules
- Pour préparer marqué par fluorescence des nanoparticules CPMV pour l'injection dans l'embryon de poulet; diluer les nanoparticules virales (synthétisé comme en 8 dans du PBS, pH 7,4, à une concentration du mélange Vortex 100 pg / ml avant de l'utiliser et centrifuger pendant une minute pour enlever tout. agrégats. sonication peut également être utile en fonction de conjugués et le degré d'agrégation. Stocks de CPMVs marqué par fluorescence sont stables pendant au moins 1 an s'il est conservé à 4 ° C dans l'obscurité. Vérifiez périodiquement stocks en mettant quelques gouttes sur une lame de verre et la vérification pour la fluorescence. Transmission Electron Microscopy (TEM) peuvent également être utilisés pour déterminer si les particules restées intactes après conjugaison.
- En bref, un microgramme de nanoparticules virales (dans un volume final de 2 pl) peuvent être ajoutés à des grilles de cuivre enrobées. Ensuite, ajoutez un volume égal d'acétate d'uranyle 2% pendant 1 minute à microscope électronique (Philips EM 410).
3. L'injection intraveineuse d'marqués à la fluorescence des nanoparticules virales
- Le Jour 16, assembler des micro-injecteur tel que décrit ci-dessus. Aspirer le volume désiré de nanoparticules virale à travers le tube dans la seringue (> 200 uL). Retirez délicatement les bulles d'air. Insérez l'aiguille de verre micro-injection à l'extrémité du tube. Assurez-vous que l'aiguille est plus longue et effilée que possible (figure 2a). Si l'aiguille est trop brutal, il ne sera pas en mesure de percer l'ectoderme et ne parviendra pas à pénétrer dans le bateau. Si l'aiguille est trop forte, la pointe va s'effondrer lors de la pénétration tissulaire.
- Intraveineuse injecter 100 ml de dextran 1 mg / ml de fluorescéine (MW 70000 Da, Invitrogen) en portant une tumeur embryonnaire distale du site désiré pour être visualisées (figure 3d). Canulation veineuse réussie de CAM est évident par la compensation de sang dans le chemin du débit d'injection (Figure 2b). Évaluer vasculaires fuites 1 heure après l'injection.
- Par voie intraveineuse d'injecter 50 ul de 1 mg / ml, solution de CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) ou pégylé CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) dans des embryons contenant les tumeurs avec fuite vasculaire distale du site désiré être visualisées.
- Tumeurs Image immédiatement et toutes les heures après l'injection en utilisant un Zeiss examinateur Z1 microscope droit équipé d'un disque Yokogawa filature, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD.
4. En temps réel d'imagerie intravitale
- Pour assembler l'unité d'imagerie embryon, appliquer une mince couche de graisse à vide autour de la circonférence du port d'imagerie sur le dessous du couvercle de l'unité d'imagerie embryon, et en forme une lamelle de verre de 18 mm sur le port.
- Position de l'embryon de telle sorte que la lamelle couvre la zone souhaitée pour l'imagerie. Abaissez lentement le couvercle jusqu'à ce que la lamelle est tout simplement le contact avec l'embryon, puis vissez le couvercle sur l'appareil pour le maintenir en place (figure 2c).
- Ajouter de l'eau chauffée à 37 ° C dans l'unité d'imagerie embryon en dehors du plat contenant l'embryon, puis placez l'unité entière sur la scène d'un microscope confocal à droite avec la chambre de l'intérieur de l'environnement équilibré à 37 ° C.
- Positionnez l'unité d'imagerie contenant l'embryon au microscope à fluorescence confocale à disque rotatif (figure 2e). L'unité d'imagerie tiendra l'embryon en place et tenir le champ de vision tout en capturant des images fixes, permettant à la fois des piles Z en trois dimensions et time-lapse de capturer des images. Nous acquérir et d'analyser en trois dimensions time-lapse images à l'aide de Perkin Elmer (anciennement Improvisation) logiciel Volocity (figure 3a). Acquérir une haute résolution en trois dimensions pile de la tumeur et les vaisseaux environnants pour visualiser detaileanalyses d structurelles spécifiques au temps des points. Acquérir en trois dimensions des piles à intervalles réguliers de temps aux points de carte détaillée des changements structurels dans la vascularisation tumorale. Tumeurs image toutes les heures après l'injection.
- Quantifier l'absorption des nanoparticules virales en calculant la moyenne Alexa Fluor (AF) 647 du signal dans des régions sélectionnées dans la tumeur ou dans le stroma (non tumoral région) en utilisant le logiciel d'image telles que la quantification Volocity (Perkin Elmer). La tumeur du stroma ratio a été calculé en divisant la moyenne AF 647 du signal dans la tumeur sur la moyenne du signal AF 647 dans le stroma. Un ratio tumeur / stroma supérieur à 1 indique que la nanoparticule est repris par la tumeur.
5. Les résultats représentatifs:
Dans l'exemple décrit ici, nous avons injecté des cellules HT-29 du cancer du colon pour former un bolus d'environ 1mm dans la taille au sein de la CAM d'embryons de poulet jour 9 (figure 1b). Après inoculation, les embryons ont été cultivés pendant 7 jours dans un incubateur humidifié pour permettre la croissance tumorale et la vascularisation suffisante (figure 1c). Les embryons ont été injectés par voie intraveineuse avec un faible poids moléculaire du dextrane de confirmer la vascularisation tumorale, et les tumeurs ont été visualisées au microscope Zeiss Z1 AxioExaminer verticale (figure 2d).
Après administration intraveineuse de CPMV-AF 647 ou CPMV-PEG-AF 647 nanoparticules (figure 3a et b), à haute résolution en temps réel l'imagerie confocale (figure 2e) a révélé que les deux CPMV et CPMV-PEG nanoparticules rapidement étiquetés la vascularisation entier, mais l'absorption de CPMV-PEG par la tumeur était d'environ 3 fois plus élevé que CPMV après 12 heures (figure 3a). La captation tumorale relative de nanoparticules a été déterminé en utilisant le logiciel d'analyse d'image (Volocity de Perkin Elmer). Régions d'intérêt ont été choisis au sein et en dehors de la tumeur (dans le compartiment stromal) et l'intensité moyenne de fluorescence de chacun a été déterminé. Les données sont exprimées en tumeur / stroma ratio.
Figure 1. Microinjection de tumeurs dans la CAM d'un embryon aviaire. (A) L'appareil est assemblé à partir de micro-injection des composants comme indiqué. (B) des embryons aviaire au jour 9 sont prêts à être inoculés avec la tumeur lors de la CAM s'est propagé à couvrir toute la surface. (C) Au jour 16, la tumeur aura atteint jusqu'à 1 cm de diamètre (ligne pointillée) et est prête pour l'injection des nanoparticules.
Figure 2. Injection de nanoparticules et de l'imagerie intravitale. Injection sous un microscope de dissection montrant (a) la pointe de l'aiguille microinjecteur prêt à être injecté dans la veine CAM et (b) l'aiguille microinjecteur inséré dans la veine (indiqué par la flèche) et de nanoparticules injectées dans la circulation sanguine (vu par compensation de sang). (C) l'unité d'imagerie contenant embryon aviaire avec la lamelle interfacé directement avec la CAM. (D) Avant l'injection de nanoparticules, la vascularisation tumorale est évaluée en utilisant l'imagerie intravitale après l'injection de fluorescéine dextrane. (E) l'unité d'imagerie contenant l'embryon placé sur la platine d'un microscope confocal à droite au sein d'une régulation de température mis enceinte à 37 ° C.
Figure 3. Visualisation de l'absorption des nanoparticules intravitale dans les tumeurs humaines. Les tumeurs sont visualisées 7 heures après l'injection de (a) CPMV-AF647 et (b) CPMV-PEG-AF647. d) L'excision de la tumeur de l'embryon aviaire pour une analyse ultérieure.
Discussion
La membrane chorio (CAM) de l'embryon aviaire est un modèle utile pour évaluer la dynamique vasculaire et la pharmacocinétique de tumeurs humaines. La structure et la position de la came permet l'acquisition de haute qualité d'image et accueille de nombreux types de xénogreffes de cancer invasif, sans intervention chirurgicale. Par ailleurs, les xénogreffes de tumeurs cancéreuses implantées dans la membrane chorio devenu vascularisé dans les 7 jours, offrant un moyen rapide, peu coûteuse et semi-haut-débit pour évaluer l'accumulation de nanoparticules dans le tissu tumoral. Depuis xénogreffes de cancer implanté dans la CAM d'embryons de poulet sans coquille sont accessibles à l'optique à haute résolution d'un microscope confocal à épifluorescence ou debout, l'information contextuelle et temporelle sur la fixation des nanoparticules dans la vascularisation tumorale peut être facilement obtenu. Xénogreffes de cancer dans ce modèle ont tendance à croître latéralement à travers la CAM, résultant dans des tumeurs qui sont grandes, tout en restant inférieure à 200 m de profondeur. Cela les rend particulièrement bien adapté pour l'imagerie intravitale parce norme microscopes à épifluorescence peut pénétrer efficacement la masse tumorale entier. En revanche, les tumeurs implantées dans des sites soit superficielle ou orthotopique dans la souris prolifèrent en trois dimensions, il est difficile de localiser précisément des nanoparticules profonde au sein de ces tumeurs par des techniques non invasives. Nous avons utilisé ce modèle pour évaluer l'absorption des quantum dots, des liposomes, des nanoparticules d'oxyde de fer et dans un certain nombre de xénogreffes tumorales humaines, soulignant le potentiel de ce modèle soit adapté à l'analyse in vivo d'une large gamme de formulations de nanoparticules.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par IRSCC # 700537 Grant et subvention des IRSC # 84535 à la LDJ et le NIH / NCI octroi # CA120711-01A1-01A1 et CA120711 à AZ. Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les règlements et les directives de l'Institutional Animal Care et utilisation comité à l'Université de Californie à San Diego, soins des animaux et l'utilisation à l'Université de Western Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
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