Summary
我们提出了一个新颖的方法，量化动态，实时活体成像人类禽流感的胚胎模型裸鼠肿瘤血管中的纳米粒子本地化。
Abstract
如超声，MRI，PET和CT肿瘤显像，目前的技 术无法产生高清晰度的图像，为在微观层面 1,2,3的评估在肿瘤纳米粒子吸收，突出一个合适的移植瘤模型的效用其中，进行详细的摄取分析。在这里，我们使用了高分辨率的活体成像技术来评估纳米粒子吸收在修改过的，无壳鸡胚模型人类肿瘤异种移植。鸡胚模型是特别好，适合在体内的分析，因为它支持的人类肿瘤的生长，是价格相对低廉的，不需要麻醉或手术 4,5这些。肿瘤细胞内形成7天完全吻合血管的移植瘤的植入绒毛尿囊膜（CAM）6 。由此产生的肿瘤，可以保持长达72小时与主机或肿瘤系统的影响不大的非侵入性的实时，高清晰度成像的可视化。与远端肿瘤的大小和管理配方广泛的纳米粒子可以被可视化和量化，因为他们通过血液流动，从漏肿瘤血管中渗出，并会积聚在肿瘤部位。我们在这里描述的豇豆花叶病毒（CPMV）与近红外荧光染料和/或聚合物聚乙二醇（PEG）的7，8，9,10,11装饰所得的纳米粒子的分析。静脉给药后，这些病毒的纳米粒子迅速内由内皮细胞，导致全球标签和两个外血管内的肿瘤7,12。病毒的纳米粒子的聚乙二醇化增加了他们的血浆半衰期，延长其在流通中的时间，并最终增强了通过增强通透性和保留 （EPR）的影响，10,11肿瘤的积累。纳米粒子在肿瘤积累的速度和程度是衡量随着时间的推移，使用图像分析软件。这种技术提供了一种方法来可视化和量化在人类肿瘤的纳米粒子动力学。
Protocol
1。肿瘤接种到禽流胚胎的CAM
- 准备受精的鸡胚胎壳的说明 8 。
- 胚胎发育的第9天，组装微量进样器使用的是18号到1 mL注射器针头连接。剪下一块聚乙烯管（1 / 32“内径3 / 32”外径，1 / 32“壁厚）5-6英寸和仔细的油管插入针头斜面。大约4-5英寸的油管延长从针尖（图1a）。
- 细胞悬液填充注射器和油管。然后，一个显微注射玻璃针管端插入，并仔细清除任何气泡。
- 清扫范围与照明10,000-100,000癌细胞作为CAM（图1c）内的丸注入日，根据9个胚胎（图1b）。慢慢注入细胞，并仔细确保针在正确的地方为细胞内形成一个可见的CAM丸。凸轮表面上的滴水使用Kimwipe或其他撒施，可清洗的细胞。
- 返回胚胎培养箱在38℃，湿度在60％，并允许肿瘤生长和血管（7天）。
2。纳米粒子的制备
- 为了准备注射到鸡胚胎CPMV纳米粒子的荧光标记;淡化（合成为8 PBS，pH值7.4，前一分钟的使用和离心机，以消除任何浓度100微克/毫升的旋涡混合的病毒粒子。根据共轭和聚集程度，也可能是有用的集合体。超声荧光标记的CPMVs存货至少1年的稳定存储在4 ° C黑暗环境中检查周期性地把一对夫妇的股票跌落到载玻片荧光检查。透射电子显微镜（TEM）也可以被用来确定颗粒保持完好后，共轭。
- 简言之，一微克的病毒粒子（在最后的2μL卷），可以添加到镀铜电网。接下来，添加等体积1分钟在电子显微镜（飞利浦EM 410）2％醋酸铀。
3。静脉注射病毒荧光标记的纳米粒子
- 16日，组装微量进样器，如上面所述。通过到注射器管（> 200μL）绘制所需的病毒纳米粒子的体积。小心地取出任何气泡。显微注射玻璃针管端插入。确保针只要尽可能的锥形（图2a）。如果针头太钝，它不会被皮尔斯能够通过外胚层，将无法穿透血管。如果针头太锋利，针尖穿透组织时就会崩溃。
- 静脉注射注入荷瘤胚胎从远端所需的站点100μL1毫克/毫升荧光右旋糖酐（MW 70000大，Invitrogen公司），可视化（图3d）。成功的CAM静脉插管是显而易见的，清除血液中注射流的路径（图2b）。评估后注射血管渗漏1小时。
- 静脉注射注入胚胎含有肿瘤血管渗漏所需的站点从远端CPMV的Alexa Fluor 647（647 CPMV - AF）或聚乙二醇CPMV的Alexa Fluor 647（CPMV - PEG - 647自动对焦）为1 mg / ml的溶液50μL可视化。
- 影像肿瘤立即和每一个小时后注射使用蔡司主任Z1与横河电机的旋转盘，滨松IMAGEM 9100-12 EM - CCD摄像头直立显微镜安装。
4。实时活体成像
- 要组装的胚胎成像单元，应用胚胎成像单元的盖子底面周长成像端口周围薄薄的一层真空润滑脂，适合到端口18毫米的玻璃盖玻片。
- 盖玻片盖成像所需的区域位置的胚胎。慢慢放下盖子，直到盖玻片与胚胎接触，然后再拧上盖子的单位举行的地方（图2c）。
- 将水加热至37 ° C到外面的菜含有胚胎的胚胎成像单元，然后放到一个堂堂正正的共聚焦显微镜的阶段与整个单位的内部环境室平衡至37 ° C。
- 位置成像装置，旋转盘共聚焦荧光显微镜（图2E）含有胚胎。成像装置将举行到位的胚胎，并保持固定拍摄图像时的视野，从而为立体ž堆栈和时间推移图像被捕获。我们采集和分析时间推移三维图像，使用Perkin Elmer公司（前身为即兴）Volocity软件包（图3a）。采集的肿瘤高分辨率三维堆叠和周围血管可视化detaile在特定时间点的三维结构分析。收购定期的时间点的三维堆叠地图详细的结构变化，在肿瘤血管。每隔一小时注射后的图像肿瘤。
- 病毒粒子的摄取定量计算平均值的Alexa Fluor（AF）的647在肿瘤或基质（非肿瘤区）的形象，如Volocity定量分析软件（Perkin Elmer公司）在选定区域内的信号。肿瘤基质的比例计算，除以平均AF 647基质的信号平均AF 647在肿瘤的信号。肿瘤/间质比高于1，表示正在采取由肿瘤的纳米颗粒。
5。代表性的成果：
在这里所描述的例子，我们注入了HT - 29结肠癌细胞内形成一个约1mm大小的丸9天鸡胚胎（图1b）的凸轮。接种后，胚胎培养在培养箱7天，以允许足够的肿瘤生长和血管生成（图1c）。胚胎与低分子右旋糖酐静脉注射，以确认肿瘤血管生成，肿瘤蔡司AxioExaminer Z1直立显微镜（图2d）下的可视化。
（图3a和b）经静脉给药CPMV - 647自动对焦或CPMV PEG -自动对焦647纳米粒子，高清晰度的实时共焦成像（图2E）透露，CPMV和CPMV - PEG纳米颗粒迅速标记整个血管，但CPMV - PEG肿瘤摄取比CPMV高出约3倍，在12小时后（图3a）。纳米粒子的相对肿瘤摄取确定使用图像分析软件（Perkin Elmer公司Volocity）。选择感兴趣区域内部和外部的肿瘤（基质车厢），平均每个荧光强度测定。数据表示为肿瘤/间质比。
图1。肿瘤微量注射禽流胚胎的凸轮。 （一）显微注射器具是从组件组装表示。 （二）在9天的禽流感胚胎准备与肿瘤接种当凸轮已经蔓延到覆盖整个表面。 （c）在第16天，将有成长为肿瘤直径在1厘米（虚线），并准备注入纳米粒子。
图2纳米粒子注射液和活体成像。注射显示显微镜下解剖（一）微量注射器针头尖端的CAM静脉注入（二）微量注射器针头插入静脉（箭头表示）和纳米粒子注射到血流（通过清除看到血）。 （三）成像单元含盖玻片直接与CAM接口禽流胚胎。 （四）纳米粒子注射之前，评估肿瘤血管生成是使用荧光右旋糖酐注射后的活体成像。 （E）成像单元含有胚胎定位，内温度调节的外壳设置一个堂堂正正的共聚焦显微镜阶段至37 ° C
图3纳米粒子吸收在人类肿瘤的活体可视化。 7小时后注射（一）CPMV - AF647及（b）CPMV PEG - AF647肿瘤可视化。 D）切除肿瘤禽流胚胎以供后续分析。
Discussion
禽流胚胎绒毛尿囊膜（CAM）是一个有用的模型，以评估血管动力学和人类肿瘤的药代动力学。 CAM的结构和位置，让高品质的图像采集和容纳多种癌裸鼠移植瘤无侵入性外科手术。此外，癌症肿瘤异种移植植入成为7天之内，带血管的绒毛尿囊膜，提供了一种快速，廉价和半高通量的手段来评估纳米粒子在肿瘤组织中的积累。由于植入癌裸鼠移植瘤在无壳鸡胚CAM是一个堂堂正正的epifluorescence或共聚焦显微镜，纳米粒子在肿瘤血管吸收的背景和时间信息的高清晰度光学的，可以很容易地获得。在此模型中的肿瘤异种移植物往往生长横向跨越CAM，造成大的肿瘤，而其余的在深度小于200米。这使得它们特别适合活体成像，因为标准epifluorescence的显微镜可以有效地渗透到整个肿块。相比之下，要么肤浅或原位网站中植入肿瘤内鼠标在三维空间中扩散，使得很难准确的本地化深纳米粒子在这些肿瘤的非侵入性技术。我们利用这个模型来评估吸收的量子点，脂质体和铁的氧化物纳米粒子在人类肿瘤异种移植的数量，突出了这种模式的潜力，适合在体内广泛的纳米粒子配方分析。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由CCSRI格兰特＃700537和＃84535 JDL和NIH / NCI授予＃CA120711 - 01A1和CA120711 - 01A1对AZ CIHR格兰特支持。所有实验均在依照法规和准则的体制动物保健和使用在加利福尼亚大学圣迭戈分校，动物保健大学的委员会，并使用在加拿大西安大略大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
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