Summary
Biz bir kuş embriyo modeli dinamik, gerçek zamanlı intravital görüntüleme kullanarak insan xenografted tümörlerin vasküler nanoparçacık yerelleştirme ölçmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.
Abstract
Mevcut teknolojiler gibi ultrason, MR, PET ve CT gibi tümör görüntüleme için uygun bir xenograftlarının modeli yararını vurgulayarak, mikroskobik düzeyde 1,2,3 tümörleri nanoparçacık alımını değerlendirilmesi için yüksek çözünürlüklü görüntüler veremezken Ayrıntılı alımı analizleri yapmak için hangi. Burada, değiştirilmiş bir kabuk, tavuk embriyo modeli insan tümör xenografts nanoparçacık alımını değerlendirmek için, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme kullanın. Tavuk embriyo modeli özellikle in vivo analizlerde, insan tümörlerinin büyümesini destekleyen, nispeten ucuz ve 4,5 anesthetization veya cerrahi gerektirmez, çünkü bunlar için iyi uygundur . Chorioallantoic membran (CAM) 6 içine implante Tümör hücreleri, 7 gün içinde tamamen vaskülare xenografts oluşturur . Ortaya çıkan tümörler, ya ev sahibi veya tümör sistemleri üzerinde çok az etkisi ile 72 saate kadar korunabilir non-invaziv, gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme tarafından görüntülenmiştir. Tümör distal uygulanan boyutları ve formülasyonları geniş bir yelpazesi ile Nanopartiküller görüntülenebilmekte ve kan yoluyla akışı gibi sayısal olabilir, sızdıran tümör damarsal extravasate ve tümör yerinde biriken. Biz burada, yakın-kızılötesi floresan boyalar ve / veya polietilen glikol (PEG) polimerler 7, 8, 9,10,11 süslenmiş Börülce mozaik virüsü (CPMV) türetilen nanoparçacıkların analizi açıklanmaktadır . Intravenöz üzerine, bu viral nanopartiküller dışında damar küresel etiketleme ve tümör 7,12 içinde hızla endotel hücreleri tarafından içselleştirilmiş. Viral nanopartiküller PEGylation plazma yarılanma ömrü artırır, kan dolaşımını zamanlarını uzatır ve sonuçta gelişmiş geçirgenlik ve retansiyonu (EPR) etkisi 7, 10,11 ile tümörlerin birikimi artırır. Görüntü analiz yazılımı kullanarak bir tümör nanoparçacıkların birikimi hızı ve kapsamı zamanla ölçülür. Bu teknik, hem de görselleştirmek ve insan tümörlerinde nanoparçacık dinamiklerini ölçmek için bir yöntem sağlar.
Protocol
1. Kuş embriyo CAM içine tümör Aşılama
- Kabuk az döllenmiş tavuk embriyolar 8 açıklandığı gibi hazırlayın.
- Embriyonik gelişim Gün 9, 1 ml şırınga üzerine bağlı 18-gauge iğne kullanılarak bir mikro enjektör montajı. 5-6 inç Tygon boru (1 / 32 "iç çapı, 3 / 32" dış çapı, 1 / 32 "duvar kalınlığı) bir parça kesin ve tüp içine iğne konik dikkatlice yerleştirin. Tüp yaklaşık 4-5 cm iğne ucu kadar uzanır (Şekil 1a).
- Hücre süspansiyonu ile şırınga ve tüp doldurun. Daha sonra, boru sonunda mikroenjeksiyon cam iğne takın ve dikkatli bir şekilde herhangi bir hava kabarcıkları.
- Gün ışığı ile CAM (Şekil 1c) içinde bolus olarak 10,000-100,000 kanser hücreleri bir diseksiyon kapsamında 9 embriyolar (Şekil 1b) enjekte edilir. Hücreleri enjekte yavaş yavaş ve dikkatli bir iğne CAM içinde görünür bir bolus oluşturmak için hücreleri için doğru yerde olduğundan emin olun. Hücreler CAM yüzeye damla Kimwipe veya diğer aplikatör kullanılarak temizlenebilir.
- % 60 nem ve 38 ° C'de nemlendirilmiş inkübatör embriyo dönün ve tümör izin büyümeye ve vascularize (7 güne kadar).
2. Nanoparçacıkların hazırlanması
- Tavuk embriyo içine enjeksiyon için floresan etiketli CPMV nanopartiküller hazırlamak için; viral nanopartiküller (herhangi kaldırmak için kullanarak ve bir dakika boyunca santrifüj önce 100 mg / ml Vortex karışımı bir konsantrasyon, PBS, pH 7.4 8 olarak sentezlenmiş sulandırmak toplar. Sonikasyon konjugatları ve agregasyon derecesi bağlı olarak yararlı olabilir 4 saklandığında floresan etiketli CPMVs stokları en az 1 yıl boyunca stabildir ° C karanlıkta bir çift koyarak stokları periyodik olarak kontrol edin bir cam slayt üzerine düşer ve floresan kontrol Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) parçacıklar konjugasyon sonra değişmediğini belirlemek için kullanılır.
- Kısaca, viral nanoparçacıkların bir mikrogram (2 ul nihai hacmi) bakır kaplı ızgaraları eklenebilir. Sonra, bir eşit miktarda elektron mikroskobu (Philips EM 410) az 1 dakika süreyle% 2 oranında uranil asetat ekleyin.
3. Floresan etiketli viral nanoparçacıkların İntravenöz enjeksiyon
- 16 Gün, yukarıda açıklandığı gibi mikro enjektör montajı. Şırıngaya boru (> 200 mcL) ile viral nanoparçacık istenilen hacmi çizin. Herhangi bir hava kabarcığı dikkatlice çıkarın. Mikroenjeksiyon cam boru sonunda iğne takın. Iğne kadar uzun ve mümkün olduğunca konik (Şekil 2a) olduğundan emin olun. Iğne çok künt ise, ektoderm ile delmek için mümkün olmayacaktır ve gemi nüfuz başarısız olur. Iğne çok keskin ise doku nüfuz ederken, ucu çökecek.
- İstediğiniz siteye distal tümör taşıyan embriyo haline intravenöz (Şekil 3d) görüntülenebilmekte 1 mg / ml flöresein dekstran (MW 70.000 Da, Invitrogen) 100 ul enjekte edilir. Başarılı CAM ven kanülasyonu enjeksiyon akış yolu kan temizleme (Şekil 2b) tarafından açıktır. Enjeksiyon sonrası vasküler sızıntı 1 saat değerlendirin.
- İstediğiniz siteye distal vasküler sızıntı tümörleri içeren embriyolar halinde intravenöz CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) veya pegile CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) 1 mg / ml solüsyon enjekte 50 ul görüntülenebilmekte.
- Görüntü hemen tümörler ve enjeksiyondan sonra bir Yokogawa dönen disk, Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD kamera ile donatılmış bir Zeiss Examiner Z1 dik bir mikroskop kullanılarak her saat.
4. Gerçek zamanlı intravital görüntüleme
- Embriyo görüntüleme birimi bir araya getirmek için, vakum gres embriyo görüntüleme ünitesi kapağın alt görüntüleme liman çevresinde ince bir tabaka halinde uygulayın ve liman üzerine 18 mm cam lamel uyacak.
- Lamel görüntüleme için istediğiniz alanı kapsayacak böyle embriyo yerleştirin. Lamel yavaşça embriyo ile temas edinceye kadar kapağı düşük ve daha sonra birim üzerine kapağı vidalı bir yerde tutun (Şekil 2c).
- Embriyo içeren çanak dışında embriyo görüntüleme ünitesi içine 37 ° C sıcak su ekleyin ve sonra 37 dengelenmiş içinde çevre odasına ° C ile dik bir konfokal mikroskop sahneye tüm birim
- İplik disk konfokal floresan mikroskobu (Şekil 2e) altında embriyo içeren Pozisyon görüntüleme ünitesi. Görüntüleme ünitesi yakalanan üç boyutlu Z yığınları ve zaman atlamalı görüntüleri için izin, yer embriyo tutun ve görüş alanı yakalama görüntüleri ise sabit tutmak. Biz kazanmak ve Perkin Elmer (eski Doğaçlama) Volocity yazılım paketi (Şekil 3a) kullanarak üç boyutlu zaman atlamalı görüntüleri analiz. Tümörün üç boyutlu bir yığın yüksek çözünürlüklü ve detaile görselleştirmek için çevreleyen damar kazanmakd belirli bir zaman noktalarında yapısal analizler. Tümör damarsal ayrıntılı yapısal değişiklikler eşlemek için normal süre noktaları üç boyutlu yığınlar edinin. Görüntü tümörler her enjeksiyondan sonra saat.
- Hesaplayarak ortalama Alexa Fluor (AF), tümör ya da böyle bir Volocity olarak stroma (non-tümör alan) kullanarak görüntü kantitatif yazılımı (Perkin Elmer) seçilen bölgeler içinde 647 sinyal alımını viral nanoparçacıkların Asitli. Stroma oranı tümör stroma ortalama AF 647 sinyal üzerinde tümörün ortalama AF 647 sinyal bölünmesi ile hesaplandı. Tümör / stroma oranı 1'den yüksek bir nanoparçacık tümörün alındığını olduğunu gösterir.
5. Temsilcisi sonuçları:
Örneğin burada anlatılan, biz günde 9 tavuk embriyolar (Şekil 1b) CAM içinde yaklaşık 1 mm boyutunda bir bolus oluşturmak için HT-29 kolon kanseri hücreleri enjekte etti. Aşılama sonra, embriyolar yeterli tümör büyümesi ve vaskülarizasyon (Şekil 1c) izin nemlendirilmiş bir inkübatör 7 gün süreyle kültüre edildi. Embriyolar tümör vaskülarizasyon onaylamak düşük molekül ağırlıklı dekstran ile intravenöz enjekte edildi ve tümörler Zeiss AxioExaminer Z1 dik mikroskobu (Şekil 2d) altında görüntülendi.
CPMV-AF 647 veya CPMV-PEG-AF 647 nanopartiküller intravenöz uygulamadan sonra (Şekil 3a ve b), yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı konfokal görüntüleme (Şekil 2e) CPMV ve CPMV-PEG hızla tüm damarsal etiketli nanopartiküller saptandı, ancak tümör CPMV-PEG alımı (Şekil 3a) 12 saat sonra, CPMV daha yaklaşık 3 kat daha yüksek oldu. Nanoparçacıkların nispi tümör alımı, görüntü analiz yazılımı (Perkin Elmer Volocity) kullanılarak tespit edildi. Tümör içinde ve dışında ilgi Bölgeler seçildi (stromal bölmesi) ve her birinin ortalama floresan yoğunluğu tespit edilmiştir. Veri tümör / stroma oranı olarak ifade edilir.
Şekil 1 bir kuş embriyo CAM içine tümörlerin Mikroenjeksiyon. Belirtildiği gibi (a) mikroenjeksiyon cihaz bileşenleri bir araya. (B) 9 gün Kuş embriyolar CAM tüm yüzeyini kapsayacak şekilde yayıldı tümör ile aşılanmış olmak için hazırız. (C) 16 gün, tümör çapı 1 cm (kesikli çizgi) kadar büyüdü ve nanopartiküller ile enjeksiyon için hazır olacak.
Şekil 2 Nanopartikül enjeksiyon ve intravital görüntüleme. Gösteren bir diseksiyon mikroskop altında enjeksiyon (a), (temizleyerek görülen CAM damar içine enjekte edilir ve (b) mikroenjektör iğne kan akımı enjekte nanopartiküller damar içine eklenir (ok ile gösterilir) ve hazır mikroenjektör iğne ucu kan). (C) Görüntüleme birimi lamel CAM ile doğrudan arabirim ile kuş embriyo içeren. (D) nanoparçacık enjeksiyon öncesinde, tümör vaskülarizasyon floresein dekstran enjeksiyondan sonra intravital görüntüleme ile değerlendirildi. (E) Görüntüleme Ünitesi, 37 ° C sıcaklığa ayarlı muhafaza kümesi içinde dik bir konfokal mikroskop sahnede yer embriyo içeren
Şekil 3 insan tümörlerinde nanoparçacık alımı intravital görselleştirme. Tümörler (a) CPMV-AF647, (b) CPMV-PEG-AF647 enjeksiyonundan 7 saat sonra görüntülenir. d) sonraki analiz için kuş embriyo tümör eksizyonu.
Discussion
Kuş embriyo chorioallantoic membran (CAM), vasküler dinamikler ve insan tümörlerinde farmakokinetiği değerlendirmek için kullanışlı bir modeldir. CAM yapısı ve konumu, yüksek kalitede görüntü elde etme sağlar ve invaziv cerrahi prosedürler olmaksızın birçok türde kanser xenografts barındırmaktadır. Ayrıca, kanser tümörü xenografts, tümör dokusu nanoparçacıkların birikimi değerlendirmek için hızlı, ucuz ve yarı-yüksek verimlilik anlamına gelir sunan, 7 gün içinde vaskülarize haline chorioallantoic membran yerleştirilir. CAM kabuk az tavuk embriyoların implante kanser xenografts tümör damarsal nanoparçacık alımı ile ilgili bir dik Epifloresans veya konfokal mikroskop, bağlamsal ve zamansal bilgiler yüksek çözünürlüklü optik erişilebilir olduğundan kolayca elde edilebilir. Bu modelde Kanser xenografts az 200 m derinlikte kalarak büyük tümörlerde, CAM üzerinde yanal büyümek eğilimindedir. Standart Epifloresans mikroskopları tüm tümör kitlesi etkin bir şekilde nüfuz eder, çünkü bu, onları özellikle iyi intravital görüntüleme için uygun hale getirir. Buna karşılık, fare içinde yüzeyel veya ortotopik siteleri ya implante tümörler zor non-invaziv teknikleri ile bu tümörler içinde derin nanopartiküller doğru lokalize etmek, üç boyutlu olarak çoğalırlar. Biz geniş bir yelpazede nanoparçacık formülasyonların in vivo analizi için uygun olduğu için bu model için potansiyel vurgulayarak, kuantum noktaları, lipozomlar ve demir oksit, insan tümör xenografts bir dizi nanopartiküller alımını değerlendirmek için bu model kullanılır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmada CCSRI Hibe # 700.537 ve CIHR Hibe JDL ve NIH / NCI hibe # CA120711-01A1 ve AZ CA120711-01A1 # 84.535 tarafından desteklenmiştir. Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım yönetmelik ve yönergeler doğrultusunda gerçekleştirilen ve California San Diego, Hayvan Bakım Üniversitesi'nde Komitesi kullanın ve Western Ontario Üniversitesi'nde kullanın.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
- Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).
- Judenhofer, M. S. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging. Nat Med. 14, 459-465 (2008).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Chambers, A. F., Ling, V. Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer. Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).
- Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer cell. 13, 221-234 (2008).
- Lewis, J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nature medicine. 12, 354-360 (2006).
- Leong, H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).
- Chatterji, A. New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).
- Brunel, F. M. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).
- Steinmetz, N. F., Manchester, M. PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo. Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine. , Forthcoming (2010).
