Summary
Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.
Abstract
Aktuelle Technologien für die Tumor-Bildgebung, wie Ultraschall, MRT, PET und CT sind nicht in der Lage, hochauflösende Bilder für die Beurteilung der Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren auf der mikroskopischen Ebene 1,2,3 ergeben, Hervorhebung der Nützlichkeit eines geeigneten Xenograftmodell in die detaillierte Aufnahme Analysen durchzuführen. Hier verwenden wir hochauflösende intravital Bildgebung Nanopartikel-Aufnahme in menschliche Tumorxenotransplantate in einer modifizierten, Shell-less Hühnerembryo-Modell zu bewerten. Der Hühnerembryo Modell ist besonders für diese in vivo-Analysen gut geeignet, da es das Wachstum von Tumoren beim Menschen unterstützt, ist relativ kostengünstig und erfordert keine Betäubung oder Operation 4,5. Tumorzellen Formular vollständig vaskularisiert Xenotransplantate innerhalb von 7 Tagen, wenn sie in der Chorioallantoismembran (CAM) 6 implantiert. Die daraus resultierenden Tumoren werden visualisiert durch nicht-invasive Echtzeit, hoch auflösende Bildgebung, hielten bis zu 72 Stunden mit wenig Einfluss sowohl auf dem Host-oder Tumor-Systemen werden kann. Nanopartikel mit einer breiten Palette von Größen und Formulierungen verabreicht distal des Tumors können visualisiert und quantifiziert werden, da sie fließen durch den Blutkreislauf, die von undichten der Gefäßversorgung des Tumors extravasieren und reichern sich am Ort des Tumors. Wir beschreiben hier die Analyse von Nanopartikeln aus Cowpea Mosaik-Virus (CPMV) mit Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoffe und / oder Polyethylenglykol Polymere (PEG) 7, 8, 9,10,11 dekoriert abgeleitet. Bei intravenöser Verabreichung werden diese viralen Nanopartikel rasch von Endothelzellen internalisiert, was im globalen Kennzeichnung der Gefäße sowohl außerhalb als auch innerhalb des Tumors 7,12. PEGylierung des viralen Nanopartikel erhöht ihre Plasma-Halbwertszeit, erstreckt sich ihre Zeit in den Kreislauf, und schließlich steigert ihre Anhäufung in Tumoren durch die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt 7, 10,11. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Akkumulation von Nanopartikeln in einem Tumor ist über die Zeit gemessen anhand der Bildanalyse-Software. Diese Technik bietet eine Methode, um sowohl zu visualisieren und zu quantifizieren Nanopartikel Dynamik in menschlichen Tumoren.
Protocol
1. Inokulation von Tumorzellen in Vogelembryo CAM
- Bereiten Sie Shell-less befruchteten Hühner-Embryonen, wie beschrieben 8.
- Am Tag 9 der Embryonalentwicklung, montieren ein Mikro-Injektor mit einem 18-Gauge-Nadel auf 1 ml-Spritze verbunden. Schneiden Sie ein 5-6 cm Stück Tygon-Schlauch (1 / 32 "Innendurchmesser, 3 / 32" Außendurchmesser, 1 / 32 "Wandstärke) und vorsichtig einführen Fase der Nadel in den Schlauch. Ca. 4-5 cm von Schläuchen sollte erstrecken sich von der Spitze der Nadel (Abbildung 1a).
- Füllen Sie die Spritze und Schlauch mit Zellsuspension. Dann legen Sie eine Mikroinjektion Glasnadel am Ende des Schlauches und entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen.
- Inject Tag 9 Embryonen (Abb. 1b) im Rahmen einer Dissektion Umfang mit einer Beleuchtung mit 10.000-100.000 Krebszellen als Bolus innerhalb der CAM (Abbildung 1c). Langsam injizieren Zellen und sorgfältig sicherzustellen, dass die Nadel an der richtigen Stelle für die Zellen ist, um eine sichtbare Bolus innerhalb der CAM zu bilden. Zellen, die tropfen auf den CAM-Oberfläche gereinigt mit Kimwipe oder andere Applikator kann.
- Zurück Embryonen befeuchteten Inkubator bei 38 ° C bei 60% Luftfeuchtigkeit und damit der Tumor nicht wachsen und vaskularisieren (bis zu 7 Tage).
2. Herstellung von Nanopartikeln
- Um fluoreszenzmarkierten CPMV Nanopartikel für die Injektion in den Hühnerembryo vorzubereiten; verdünnen das virale Nanopartikel (synthetisiert, wie in 8 in PBS, pH 7,4, zu einer Konzentration von 100 pg / ml Vortex Mischung vor Gebrauch gut und Zentrifuge für 1 Minute auf jeder zu entfernen. Aggregate. Ultraschallbehandlung kann auch nützlich sein in Abhängigkeit von Konjugaten und den Grad der Aggregation. Stocks von fluoreszenzmarkierten CPMVs sind für mindestens 1 Jahr stabil, wenn sie bei 4 ° C im Dunkeln. Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen Aktien, indem Sie ein paar Tropfen auf einen Objektträger aus Glas und Prüfung für die Fluoreszenz. Transmission Electron Microscopy (TEM) kann auch verwendet werden um festzustellen, ob die Teilchen intakt geblieben nach der Konjugation werden.
- Kurz gesagt, kann ein Mikrogramm des viralen Nanopartikel (in einem Endvolumen von 2 ul) zu Kupfer beschichteten Gitter hinzugefügt werden. Als Nächstes fügen Sie dem gleichen Volumen von 2% Uranylacetat für 1 Minute bei Elektronenmikroskop (Philips EM 410).
3. Die intravenöse Injektion von fluoreszenzmarkierten virale Nanopartikel
- Am Tag 16, montieren Mikro-Injektor, wie oben beschrieben. Erstellen Sie gewünschte Lautstärke von viralen Nanopartikel durch den Schlauch in die Spritze (> 200 mL). Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen. Legen Sie Mikroinjektion Glasnadel am Ende des Schlauchs. Stellen Sie sicher, dass die Nadel so lange und konische wie möglich (Abbildung 2a) ist. Wenn die Nadel zu stumpf, wird er nicht in der Lage sein zu durchdringen Ektoderm und schlägt fehl, das Schiff eindringt. Wenn die Nadel ist zu scharf, wird die Spitze Zusammenbruch beim Eindringen Gewebe.
- Intravenös injizieren 100 ul 1 mg / ml Fluorescein Dextran (MG 70.000 Da, Invitrogen) in tumortragenden Embryo distal von der gewünschten Stelle sichtbar gemacht werden (Abbildung 3d). Erfolgreiche Kanülierung CAM Vene ist offensichtlich durch die Rodung von Blut in den Pfad der Einspritzmenge (Abb. 2b). Beurteilen vaskuläre Leckage 1 Stunde nach der Injektion.
- Intravenös injizieren 50 ul 1 mg / ml Lösung von CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) oder PEGylierte CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) zu Embryonen, die Tumore mit vaskulärer Leckage distal von der gewünschten Stelle zu visualisiert werden.
- Bild Tumoren sofort und zu jeder Stunde nach der Injektion mit einem Zeiss-Examiner Z1 aufrechten Mikroskop mit einer Yokogawa drehende Scheibe, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-Kamera ausgestattet.
4. Echtzeit-Bildgebung intravital
- Zur Montage des Embryos Bildeinheit, eine dünne Schicht von Vakuumfett um den Umfang der Bildgebung Anschluss auf der Unterseite des Deckels des Embryos Bildeinheit und fit mit 18 mm Deckglas auf den Hafen.
- Position des Embryos, so dass das Deckglas wird der gewünschte Bereich für die Bildgebung zu decken. Langsam senken Sie den Deckel, bis das Deckglas macht einfach Kontakt mit dem Embryo, und schrauben Sie den Deckel auf das Gerät, um es in Position zu halten (Abbildung 2c).
- Fügen Sie Wasser erwärmt auf 37 ° C in den Embryo Bildeinheit außerhalb der Schale mit dem Embryo, und dann die gesamte Einheit auf die Bühne eines aufrechten konfokalen Mikroskop mit der Innenseite Klimakammer äquilibriert bis 37 ° C.
- Positionieren Sie die Bildeinheit enthält der Embryo unter dem Spinning Disk konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2e). Die bildgebende Einheit wird der Embryo in Position zu halten und halten das Blickfeld fixiert, während die Aufnahme von Bildern, so dass für beide dreidimensionalen Z-Stapel und Zeitreihen-Aufnahmen erfasst werden. Wir erfassen und analysieren dreidimensionale Zeitraffer-Bilder mit Perkin Elmer (ehemals Improvisation) Volocity Software-Paket (Abbildung 3a). Erwerben Sie eine hochauflösende dreidimensionale Stapel des Tumors und des umgebenden Gefäße zu visualisieren detailed Strukturanalysen an bestimmten Zeitpunkten. Erwerben Sie dreidimensionale Stapel in regelmäßigen Zeit-Punkte, um detaillierte strukturelle Veränderungen in der Gefäßversorgung des Tumors Karte. Bild Tumoren jede Stunde nach der Injektion.
- Quantifizierung der Aufnahme von viralen Nanopartikel durch die Berechnung der mittleren Alexa Fluor (AF) 647-Signal in ausgewählten Regionen in den Tumor oder in das Stroma (Nicht-Tumor-Bereich) mit Bild Quantifizierung Software wie Volocity (Perkin Elmer). Der Tumor Stroma-Verhältnis wurde durch Division der mittleren AF 647-Signal in den Tumor über die mittlere AF 647-Signal in das Stroma berechnet. Ein Tumor / Stroma-Ratio von größer als 1 zeigt, dass die Nanopartikel wird durch den Tumor entnommen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
In dem hier beschriebenen Beispiel, injizierten wir HT-29 Kolonkarzinomzellen zu einem Bolus etwa 1mm in der Größe innerhalb der CAM von Tag 9 Hühnerembryonen (Abb. 1b). Nach der Impfung wurden die Embryonen für 7 Tage in einem befeuchteten Inkubator kultiviert werden, um ausreichend Tumorwachstum und Gefäßneubildung (Abbildung 1c) zu ermöglichen. Die Embryonen wurden intravenös mit einem niedermolekularen Dextran injiziert, um der Gefäßversorgung von Tumoren zu bestätigen, und die Tumore wurden unter dem Zeiss AxioExaminer Z1 aufrechten Mikroskop (Abbildung 2d) visualisiert.
Nach intravenöser Verabreichung von CPMV-AF 647 oder CPMV-PEG-AF 647-Nanopartikel (Abbildung 3a und b) mit hoher Auflösung in Echtzeit konfokale Bildgebung (Abbildung 2e) ergab, dass sowohl CPMV und CPMV-PEG-Nanopartikeln schnell beschriftet das gesamte Gefäßsystem, aber die Aufnahme von CPMV-PEG durch den Tumor war etwa 3 mal höher als CPMV nach 12 Stunden (Abbildung 3a). Die relative Tumor Aufnahme von Nanopartikeln wurde mit Bildanalyse-Software (Volocity von Perkin Elmer). Regionen von Interesse waren innerhalb und außerhalb der Tumor ausgewählt (im Stroma) und die mittlere Fluoreszenzintensität der einzelnen bestimmt. Die Daten werden als Tumor / Stroma-Verhältnis ausgedrückt.
Abbildung 1. Mikroinjektion von Tumoren in den CAM eines Vogelembryo. (A) Die Mikroinjektion Vorrichtung ist aus den Komponenten zusammengesetzt wie angegeben. (B) Vogelembryonen am Tag 9 sind bereit, mit Tumor geimpft werden, wenn die CAM ausgebreitet hat, die gesamte Oberfläche bedeckt. (C) Am Tag 16 wird der Tumor gewachsen sein, bis zu 1 cm im Durchmesser (gestrichelte Linie) und ist bereit für die Injektion mit Nanopartikeln.
Abbildung 2. Nanopartikel-Einspritzung und intravital Bildgebung. Injection unter einem Dissektionsmikroskop zeigt (a) die Spitze des Mikroinjektor Nadel bereit, in die CAM Vene injiziert werden und (b) die Mikroinjektor Nadel in die Vene eingeführt (durch Pfeil gekennzeichnet) und Nanopartikel injiziert in den Blutfluss (gesehen durch das Löschen des Blutes). (C) Imaging-Einheit mit Vogelembryo mit dem Deckglas eine Schnittstelle direkt mit dem CAM. (D) Vor der Nanopartikel-Injektion wird der Gefäßversorgung von Tumoren untersucht mit Hilfe der Intravitalmikroskopie Bildgebung nach der Injektion von Fluorescein Dextran. (E) Imaging-Einheit mit dem Embryo auf der Bühne eines aufrechten konfokalen Mikroskop in einem temperierten Gehäuse gesetzt positioniert, um 37 ° C.
Abbildung 3. Intravital Visualisierung von Nanopartikeln Aufnahme in menschlichen Tumoren. Tumoren sind 7 Stunden nach der Injektion von (a) CPMV-AF647 und (b) CPMV-PEG-AF647 visualisiert. d) Exzision des Tumors aus Vogelembryo für die spätere Analyse.
Discussion
Die Chorioallantoismembran (CAM) der Vogelembryo ist ein nützliches Modell für die vaskuläre Dynamik und Pharmakokinetik von humanen Tumoren zu bewerten. Die Struktur und die Position der CAM ermöglicht qualitativ hochwertige Bildaufnahme und bietet Platz für viele Arten von Krebs Xenotransplantate ohne invasive chirurgische Eingriffe. Darüber hinaus Krebs Tumorxenotransplantaten in der Chorioallantoismembran geworden vaskularisierten innerhalb von 7 Tagen implantiert und bietet eine schnelle, kostengünstige und semi-High-Throughput-Mittel, um die Akkumulation von Nanopartikeln in Tumorgewebe zu beurteilen. Da Krebs Xenotransplantate in der CAM des Shell-less Hühnerembryonen implantiert zugänglich hochauflösende Optik eines aufrechten Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskop, kontextuellen und zeitlichen Informationen über Nanopartikel-Aufnahme in der Gefäßversorgung des Tumors sind, können leicht erreicht werden. Cancer Xenotransplantate in diesem Modell eher zu wachsen seitlich über den CAM, was in Tumoren, die groß sind, während noch weniger als 200 m in die Tiefe. Das macht sie besonders für intravitale Bildgebung gut geeignet, da Standard-Epifluoreszenz Mikroskope effektiv durchdringen kann die gesamte Tumormasse. Im Gegensatz dazu vermehren Tumoren entweder oberflächlich oder orthotopen Stellen innerhalb der Maus implantiert in drei Dimensionen, so dass es schwierig, genau zu lokalisieren Nanopartikel tief in diesen Tumoren durch nicht-invasive Techniken. Wir haben dieses Modell benutzt, um die Aufnahme von Quantenpunkten, Liposomen und Eisenoxid-Nanopartikel in einer Reihe von menschlichen Tumorxenotransplantaten zu beurteilen, das auf das Potential für dieses Modell geeignet zu sein für die in vivo Analyse einer breiten Palette von Nanopartikel-Formulierungen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von CCSRI Grant # 700537 und CIHR Grant # 84535 zu JDL und NIH / NCI gewähren # CA120711-01A1 und CA120711-01A1 auf AZ unterstützt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss an der University of California San Diego, Animal Care und Nutzung an der University of Western Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized leghorn eggs | Frey`s Hatchery, St. Jacobs | N/A | |
| Dremel rotary tool | Dremel | Can used any model | |
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Ethanol | 70% (vol/vol) | ||
| Polystyrene weigh boats | VWR international | 12577-01 | |
| Square Petri dishes | Simport | 25378-115 | |
| Rubbermaid rubber container with lid | Guillevin | RH3-228-00-BLU | holes drilled into sides |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | model 720 | Settings: 16.3 (heater) and 2.3 (solenoid) |
Sodium borosilicate glass capillary tubes |
Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | (OD, 1.0 mm; ID 0.58 mm; 10-cm length) |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | |||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 12483-020 | Heat inactivate |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5811 000.010 | |
| Fine-point forceps | VWR international | 25607-856 | |
| Tygon R-3603 tubing | VWR international | 63009-983 | 50 ft (1/32-inch inner diameter, 3/32-inch outer diameter, 1/32-inch wall thickness |
| Hypodermic needles for injections 18-gauge needles | BD Biosciences | 305195 | Box of 100 |
| 1 ml syringes for injections | BD Biosciences | 309602 | Box of 100 |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| kimwipes | VWR international | 10805-905 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| Indoor growth lights | SunLite, Gardener’s Supply | ||
| Methyl-PEO4-NHS ester | Pierce, Thermo Scientific | PI22341 | |
| mPEG-NHS, PEG succinimidyl ester, MW 2000 | NANOCS | PEG1-0002 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid (succinimidyl ester) | Invitrogen | A20006 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester * 6-isomer * | Invitrogen | O-6149 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dibasic monohydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 379980 | K2HPO4 (for phopshate buffer) |
| Monobasic dihydrogen phosphate | P5655 | KH2PO4 (for phopshate buffer) | |
| Superose 6 size-exclusion column | GE Healthcare | 17-0673-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | WS-AKTA100 | |
| ÄKTA high flow kit | GE Healthcare | 18-1154-85 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| SW 28 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 342204 | Swing bucket |
| 50.2 Ti rotor | Beckman Coulter Inc. | 337901 | Fixed angle |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC910008 | 100 kDa cut off |
| Gradient former | Bio-Rad | ||
| dextran, fluorescein, 70,000 MW, anionic | Invitrogen | D1823 | |
| Spinning disk confocal fluorescence microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Epifluorescence wide-field microscope | Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss | N/A | |
| Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD camera | Quorum; Hamamatsu | N/A | |
| Temperature enclosure unit for microscope | Precision Plastics | N/A | |
| Vacuum grease | VWR international | 59344-055 | |
| Circular glass coverslips no. 1 (18 mm) | VWR international | 16004-300 | |
| Volocity software | PerkinElmer, Inc. | ||
| Chick embryo enclosure | custom fabricated | ||
| Delicate scissors | VWR international | 25608-203 | |
| Formalin | BioShop Canada | FOR201.500 | Use in fumehood |
| Optimal Cutting | Fisher Scientific | 1437365 | |
| Temperature (OCT) | |||
| Plastic moulds | Fisher Scientific | 22-038217 | |
| VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides | VWR international | 16004-406 | |
| Prolong gold with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Disposable blades for cryostat | Fisher Scientific | 12-634-2 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | 14047033518 |
References
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