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Biology

Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo

Published: August 5, 2011 doi: 10.3791/2809
* These authors contributed equally

Summary

Un método de citometría de flujo para la identificación y el análisis molecular de la diferenciación de etapas específicas de murino progenitores eritroides y precursores, directamente en la médula ósea recién cosechadas del ratón, el bazo o el hígado fetal. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119 y tamaño de la celda.

Abstract

El estudio de la eritropoyesis tiene como objetivo entender cómo las células rojas se forman a partir de progenitores hematopoyéticos y antes eritroides. En concreto, la tasa de formación de glóbulos rojos está regulada por la hormona eritropoyetina (EPO), cuya síntesis es provocada por la hipoxia tisular. Una amenaza para la adecuada oxigenación a los tejidos en los resultados de un rápido aumento de la EPO, impulsando un aumento en la tasa de eritropoyesis, un proceso conocido como la respuesta al estrés eritropoyética. El aumento resultante en el número de glóbulos rojos mejora la entrega de oxígeno tisular. Una respuesta eficaz estrés eritropoyética tanto, es fundamental para la supervivencia y la recuperación de las condiciones fisiológicas y patológicas como la altitud, anemia, hemorragia, la quimioterapia o trasplante de células madre.

El ratón es un modelo clave para el estudio de la eritropoyesis y su respuesta al estrés. Eritropoyesis definitiva del ratón (tipo adulto) se lleva a cabo en el hígado fetal entre los días embrionarias 12,5 y 15,5, en el bazo neonatal, y en el bazo y la médula ósea adulta. Los métodos clásicos de identificación de los progenitores eritroides en el tejido de confiar en la capacidad de estas células para dar lugar a colonias de glóbulos rojos cuando se siembran en la EPO que contienen medio semi-sólido. Su progenie precursores eritroides se identifican con base en criterios morfológicos. Ninguno de estos métodos clásicos permiten el acceso a un gran número de diferenciación de etapas específicas de las células eritroides para el estudio molecular. Aquí presentamos un método de citometría de flujo de identificación y estudio de la diferenciación etapa específica de los progenitores eritroides y precursores, directamente en el contexto de tejido de ratón recién aisladas. El ensayo se basa en los marcadores de superficie celular CD71, Ter119, y en la citometría de flujo parámetro "dispersión frontal, que es una función del tamaño de la celda. El ensayo CD71/Ter119 puede ser usado para estudiar los progenitores eritroides en su respuesta al estrés eritropoyética en vivo, por ejemplo, en ratones con anemia o ratones alojados en condiciones de poco oxígeno. También puede ser utilizado para estudiar los progenitores eritroides directamente en los tejidos de ratones adultos o de embriones genéticamente modificados, a fin de evaluar la función específica de la vía de modificación molecular de la eritropoyesis.

Protocol

1. La recolección de los tejidos

  1. Prepare los tubos que contienen 2 a 5 ml de tampón de tinción de frío (tampón fosfato salino (PBS) con adición de 0,2% de BSA y glucosa 5 mM). Mantenga los tubos en hielo antes de la cosecha de tejidos.
  2. Ratones sacrificio acuerdo con el protocolo adecuado aprobado (por ejemplo, CO 2 por inhalación seguido por dislocación cervical).
  3. Extracción de sangre por punción cardiaca en tubos con EDTA o heparina de recogida de sangre para su posterior análisis, por ejemplo, de hematocrito, recuento de reticulocitos o análisis CBC.
  4. Cosecha el bazo y los huesos, la colocación de los tejidos de cada ratón en un tubo separado, preparado en el paso 1. Fácil acceso a las bazo es desde el lado izquierdo. De la médula ósea, la cosecha de uno o ambos fémures. Mantener el tejido cosechado en el hielo.
  5. Si lo desea, un peso del bazo. Los ratones sometidos a una respuesta de estrés eritropoyética es probable que muestran un aumento significativo en el peso del bazo.

2. Preparación de las células del bazo

  1. El uso de un pre-humedecidos 3 ml émbolo de la jeringa, empuje suavemente el bazo, o parte del bazo (lo ideal es 0,1 gramos o menos, lo que equivale a aproximadamente 10 8 células) a través de un filtro de 40 micras de células estériles (número de catálogo Fisherbrand 22363547 u otros) colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Mantenga el tubo en hielo durante este procedimiento. Lavar las células a través del filtro, con un total de 2 ml tinción de amortiguación.
  2. Pipeta suavemente la suspensión celular se esforzó por romper cualquier pequeños grupos. Si es necesario, re-deformación de las células.
  3. Lavar las células dos veces por centrifugación y vuelva a suspender en tampón frío.
  4. Contar las células utilizando un hemocitómetro. Los rendimientos típicos son 1.2 x 10 8 células / bazo. Para el análisis de citometría de flujo, volumen asignado 1 a 2.000.000 células por muestra, ya sea en los tubos de tinción FACS (BD Falcon de poliestireno de fondo redondo-tubos, 352 008) o de fondo en U placa de 96 pocillos (BD Falcon 353 910). Volumen de la muestra es de 200 l tinción, a una concentración final de células 0,5 a 1 x 10 7 células / ml o 1.2 x 10 6 células / muestra de 200 microlitros.

3. Preparación de las células de médula ósea

  1. Prepare una o jeringas de 3 ml con una aguja 26G, precargada con tinción de amortiguación frío.
  2. Quitar músculos que se insertan en el fémur con el fin de visualizar claramente el hueso.
  3. Usando tijeras quirúrgicas agudas, cortar los dos extremos del fémur, lo más cerca posible a los extremos de los huesos. Esto debe revelar un pequeño agujero en cada extremo del corte, lo que lleva en la cavidad de la médula ósea, que corre a través de la longitud del fémur.
  4. El uso de las jeringas precargadas en el paso 1, insertar la aguja en uno de estos agujeros, y lave cuidadosamente la médula a través del agujero en el otro extremo, en un tubo.
  5. Disociar las células bañadas por pipeteo suave, y la tensión a través de un colador de 40 micras, como para el bazo por encima (ver sección 2.1).
  6. Lavar las células dos veces por centrifugación en frío buffer de tinción
  7. Contar las células y resuspender como en la sección 2.4. Los rendimientos típicos son alrededor de 10 7 células por fémur.

4. Preparación de las células de hígado fetal

  1. Para preparar el tiempo del embarazo los ratones hembra, creado ratones para el apareamiento de la tarde, para examinar tapones vaginales antes de las 10 horas del día siguiente, el día en que se detectó el tapón vaginal se considera día 0,5. El personal veterinario puede ser capaz de ayudar a los investigadores que no están familiarizados con esta técnica para identificar a las mujeres embarazadas. El embarazo también puede ser determinado por el peso de vigilancia del ratón.
  2. Cronometrada embarazadas ratones hembras son sacrificadas en los días de 12,5 a 14,5 del embarazo. Los cuernos uterinos se retiran en un plato de Petri que contiene helado medio de cultivo o tinción de amortiguación.
  3. Los embriones se extraen de cada útero y el hígado del feto disecado es. Un microscopio de disección es necesario para el día embrionario 12.5 (E12.5) o menos.
  4. Hígados pueden ser disociados mecánicamente pipeteando en tampón y se procesan de forma individual en placas de 96 pozos, o agrupados en conjunto, en función de las necesidades experimentales.
  5. Un hígado fetal en E13.5 ha ~ 10 7 células. Las células se lavan dos veces en buffer de tinción y se resuspendió en 2.1 x 10 6 células / muestra de 200 l para el análisis de citometría de flujo.

5. Tinción de anticuerpos por citometría de flujo

  1. Prepare un anticuerpo primario manchas de pre-mezcla que se utilizará para todas las muestras, a excepción de las muestras de control, que contiene lo siguiente:
    • ChromePure conejo IgG (Jackson, 015-000-003), a una concentración final de 200μg/ml. Comprobar la concentración de valores en la botella (puede variar). Esto se utiliza para bloquear los receptores Fc en células de ratón, especies alternativas que pueden ser utilizados para esto son IgG de ratón o rata IgG. La elección de especies se determina por la posible presencia en el protocolo de tinción de anticuerpos secundarios contra primarios de rata / ratón / conejo anticuerpos, en cuyo caso las especies no se pueden utilizard como anticuerpos bloqueantes. Por otra parte, el 5% de suero de conejo también puede ser utilizado en lugar de IgG purificada. Otra alternativa es el uso de anticuerpos monoclonales o fragmentos Fab dirigido a los receptores Fc de ratón. El protocolo básico a continuación no incluyen los anticuerpos IgG secundaria y por lo tanto de ninguna de las tres especies pueden ser utilizados.
    • CD71-FITC, diluido 1:200 (stock 0.5mg/ml, BD Biosciences-, 553.266)
    • Ter119-PE, diluido 1:200 (stock 0.2mg/ml, BD Biosciences-, 553673)
    • Los anticuerpos adicionales dirigidos a epítopos superficie de interés, por ejemplo, anticuerpos dirigidos a Fas o FasL (ver 1,2). Mezclar la solución de anticuerpos suavemente invirtiendo el tubo 2-3 veces.
  2. Añadir 200 ul de la pre-mezcla para cada muestra de células y suavemente volver a suspender las células.
  3. Preparar las muestras de control celular de la siguiente manera:
    • "Teñir": estas células se dejan en el buffer de tinción y proporcionar la autofluorescencia de fondo de las celdas.
    • Controles "de un solo color: una de control, se requiere para cada anticuerpo / color que se utiliza en el protocolo. Las células de estos controles se tiñen bien con un anticuerpo primario conjugado directamente, o con ambos un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario conjugado. Estos controles se utilizan para corregir el solapamiento espectral entre canales.
    • "Fluorescencia menos uno" (FMO) controles: un control es necesario para cada anticuerpo / color en el protocolo: las células se tiñeron con todos los colores / anticuerpos en el protocolo, excepto por el color / del anticuerpo para el cual este es el control de FMO. El control de FMO para un canal en particular proporciona el fondo verdadero de ese canal. Puede incluir no específica del anticuerpo del mismo isotipo, conjugado y con la misma marca de fluorescencia como la prueba de anticuerpos (control de isotipo).
  4. Incubar las muestras y los controles pertinentes en el anticuerpo primario mancha en hielo durante 45 'a 1 hora en la oscuridad (colocar la cubierta de papel de aluminio en cubo de hielo).
  5. Al final de la incubación, se lavan las células mediante la adición de 3 ml de solución tampón de tinción para cada tubo de muestra y el giro de 3 'a 5' aproximadamente a 400 xg a 4 ° C. Si utiliza placas de 96 pocillos, se lavan las células tres veces en un volumen de 200 l.
  6. En su caso, aplicar el anticuerpo secundario mancha. Aplicar y lavar como para el primer anticuerpo mancha.
  7. Su caso, una mancha con anexina V se aplica al final de la incubación, utilizando un tampón HEPES como en las instrucciones del fabricante. Esta mancha se aplica durante 15 minutos a temperatura ambiente, o durante 1 hora en hielo.
  8. Las células se volvió a suspender para el análisis de citometría de flujo en la tinción de solución que contiene un tinte de ADN de células impermeable, para excluir a las células muertas. Varios colorantes de ADN están disponibles, incluyendo yoduro de propidio, 7-amino-actinomicina D (7AAD), o DAPI. La elección de entre estos depende de los canales disponibles, teniendo en cuenta los canales de toma para la tinción de anticuerpos específicos, y los canales disponibles en el citómetro de flujo. 7AAD se obtiene a partir de BD Biosciences, (559.925) y se utiliza según las instrucciones del fabricante. Para la tinción DAPI, hacer un balance de 1mg/ml en dimetilformamida (DMF) a partir de polvo (Roche, Cat # 236 276), mantener a -20 ° C y diluir 1:10.000 a 1:15.000 en buffer de tinción.

6. Citometría de flujo clasificación

  1. Las células son marcadas con anticuerpos contra CD71, Ter119, marcadores de linaje, y un tinte de viabilidad como se describe para el análisis por citometría de flujo (sección 5). La concentración de células durante el etiquetado puede ser mayor a 5 x 10 7 / ml.
  2. Mezclar un volumen igual de cada uno de los siguientes anticuerpos para hacer la mezcla maestra linaje:
    • FITC rata anti-CD41 de ratón MWReg30, BD Pharmingen 553848
    • FITC rata anti-ratón CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087
    • Hamster FITC anti-ratón CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061
    • FITC rata anti-ratón CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396
    • Rata FITC anti-ratón Ly-6G y Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126
    • Use la mezcla maestra a 1:80 (Esto es equivalente a 1:400 de dilución de cada anticuerpo acciones individuales, que son de 0,5 mg / ml).
  3. Uso bajo condiciones de presión y boquillas de clasificación de ancho. Para el Aria (BD Biosciences) utilizamos 100 μ de la boquilla, la presión de 20 psi.
  4. Colección de búfer: PBS con adición de 20% de suero fetal bovino.
  5. Para comprobar la pureza de las poblaciones ordenados, vuelva a ejecutar una pequeña alícuota de cada muestra en un búfer que contiene un tinte de viabilidad (7AAD o similar).

7. Los resultados representativos:

CD71/Ter119 coloración de los adultos de médula ósea o el bazo identifica una secuencia de desarrollo de los cuatro grupos, con la etiqueta ProE, Erya, EryB y Eryc (Figura 1) 1. Morfológicamente, estos corresponden a los eritroblastos cada vez más maduro. La Figura 1 ilustra la secuencia de disparo en la etapa de análisis de datos, lo que descarta eventos muy pequeños (incluyendo los núcleos, los glóbulos rojos), las células agregadas y las células muertas.

Expresión de proteínas de la superficie celular se puede medir de forma simultánea para cada uno de estos subconjuntos, mediante la adición de los anticuerpos relevantes en el momento mismo que Ter119 y la tinción de CD71. La figura 1 muestra un ejemplo de expresión de la superficie celular de los receptores de muerte Fas 1. Esta medición se llevó a cabo en ratones inyectados con EPO, o en el control de ratones inyectados con solución salina. Es evidente que la Epo suprime la expresión de Fas en la población Erya en vivo 1.

Expresión de las proteínas intracelulares o el estado del ciclo celular también se puede medir por las células en cada subgrupo. La figura 2 muestra un análisis representativo del ciclo celular de las células recién cosechadas de la médula ósea. Estas medidas requieren, además de la tinción de la superficie celular con CD71 y Ter119, la fijación y permeabilización de las células para el etiquetado intracelular (ver sección de Discusión).

En el hígado fetal, las células no eritroides son los primeros excluidos por gating en "Lin-'las células que son negativas para CD41, Mac-1, Gr-1, B220 y CD3 (Figura 3). Las células restantes se sub-divide en seis subgrupos, S0 a S5. La estructura precisa de las células en el hígado fetal depende de la edad embrionaria (ver sección de Discusión). Un análisis del ciclo celular representante del subgrupo de S3 en E13.5 hígado fetal se muestra (Figura 4).

Figura 1
Figura 1 El CD71/Ter119 subconjuntos eritroides en el bazo del ratón estrategia de apertura de puerta A.:.. Las células del bazo fueron procesados ​​y etiquetados con anticuerpos dirigidos a CD71, Ter119 y Fas. Esta figura muestra la estrategia de análisis después de la etapa de adquisición de datos. Histograma que muestra todos los eventos adquiridos. La puerta de diagonal representa eventos que es probable que sean las células individuales, con exclusión de dobletes o agregados más grandes. Las celdas de esta puerta se analizan más en el histograma II. Acontecimientos que tienen lugar muy pequeño, probablemente núcleos o residuos, están excluidos. Las células cerradas se muestran en el histograma III, donde DAPI de células positivas, que probablemente permeable la membrana de las células apoptóticas, se excluyen del análisis posterior. Histograma IV muestra la población como resultado de las células del bazo viable. La puerta de ProE contiene CD71 de alta Ter119 células intermedias. Ter119 células de alta se analizan más en el histograma V. Aquí CD71 células de alta se subdividen en menos maduros, grandes 'Erya' eritroblastos (CD71 Ter119 alta alta alta FSC) y el más pequeño, más maduro "EryB 'eritroblastos (CD71 alta Ter119 alto bajo FSC) . El subconjunto eritroblastos más madura es Eryc (CD71 baja Ter119 alto bajo FSC). VI histograma muestra la superficie celular expresión de Fas, específicamente en el subconjunto Erya, en ratones, en el estado basal (inyección de solución salina), y los ratones inyectados con una sola dosis de EPO. Tinción con el anticuerpo Fas se llevó a cabo simultáneamente con la tinción CD71/Ter119. B. Cytospin preparativos de células seleccionadas de cada uno de los subgrupos indicó. Las células fueron teñidas con Giemsa y con Diaminobencidina, este último genera una mancha marrón con la hemoglobina. Datos Cytospin fue publicado originalmente en Liu et al., Blood. 2006 01 de julio, 108 (1) :123-33. Epub 2006 09 de marzo.

Figura 2
Figura 2. Análisis del ciclo celular de CD71 de alta Ter119 eritroblastos de alta en la médula ósea de ratones. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con BrdU y el bazo o la médula ósea fueron cosechadas 30 a 60 minutos más tarde. Las células fueron fijadas y permeabilized y además de ser teñidas con CD71 y Ter119, se tiñeron de incorporación de BrdU en su ADN replicar con un anticuerpo monoclonal dirigido a BrdU (protocolo de fijación, la permeabilización y BrdU mancha fue de acuerdo a las instrucciones del fabricante). BrdU-positivas las células se encuentran en la fase S del ciclo. Las células en interfase se BrdU-negativas y pueden ser resueltos en las fases G1 y G2 / M, utilizando el ADN tinte 7AAD.

Figura 3
Figura 3 CD71/Ter119 subconjuntos eritroides en el hígado fetal de ratón A. estrategia de apertura de puerta:.. Las células fetales de hígado fueron etiquetados para CD71, Ter119, y un cóctel de FITC anticuerpos dirigidos a marcadores de linaje no eritroides ('Lin'). Células viables (7AAD negativos) fueron analizados para la expresión de Lin, y el Lin-células se subdividen en los S0 a S5 subconjuntos eritroides. Joven, E13 hígado fetal se compone de eritroblastos menos maduros, que se muestra por la ausencia de células maduras en el S4/S5 subconjuntos. B. Cytospin preparativos de las células se separa de cada uno de los subgrupos indicó. Las células fueron teñidas con Giemsa y con Diaminobencidina, este último genera una mancha marrón con la hemoglobina. Datos Cytospin fue originalmente pPrevistos en Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484.

Figura 4
Figura 4. Análisis del ciclo celular de hígado fetal subconjuntos eritroides. Ratones embarazadas fueron inyectados con BrdU, y el hígado fetal se cosecharon 30 a 60 minutos después, fijo, permeabilized y teñidas con anticuerpos contra CD71, Ter119 y BrdU. El ciclo celular de las células de S3 se muestra.

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Discussion

La metodología de citometría de flujo permite la investigación simultánea de cualquier función celular que puede ser detectada con un anticuerpo específico conjugado con fluorescencia o ligando, incluidos los marcadores de superficie celular, expresión de la proteína, la supervivencia celular, la señalización celular utilizando fosfato anticuerpos específicos 3 y el estado del ciclo celular. Estas mediciones se pueden hacer en cada uno de una serie de subgrupos específicos de la etapa de diferenciación, en el contexto de los tejidos recién aisladas eritropoyética. Por lo tanto, este método permite la evaluación de los cambios funcionales y moleculares en los diferentes niveles del sistema de eritropoyética, en respuesta a una amplia gama de estímulos eritropoyéticos o como resultado de mutaciones genéticas.

No es, sin anticuerpos de reactividad cruzada, y la reactividad cruzada puede ser tejido-específica. Por tanto, es importante verificar, incluso para los anticuerpos previamente probado, y su especificidad en el contexto de los tejidos eritropoyéticos, utilizando un modelo de celda nulo o derribar.

Las células de subconjuntos específicos eritroides pueden ser ordenados para el ARN o el análisis de transcriptoma. Experimentos de tipo debe utilizar bajas presiones de clasificación y las boquillas de ancho, con el fin de minimizar el esfuerzo cortante en las células. Le recomendamos que visite la pureza y la viabilidad celular después de cada experimento de clasificación. Es de destacar que en el caso de la citometría de flujo multiparamétrica, el fondo verdadero de cada color es su "FMO" de control (ver sección 5.3), que incluye, además de autofluorescencia, el fondo debido a la superposición espectral de todos los demás colores. En la etapa de análisis, el control de un subconjunto específico de "FMO" tiene que ser utilizado.

Diferenciación de la etapa de eritroblastos en el flujo cytometrically subconjuntos definidos

La citometría de flujo ProE / Erya / EryB / Eryc subconjuntos se definen en términos de expresión de los marcadores de la superficie celular y se dispersan hacia adelante. Si bien es probable que cada uno de estos subconjuntos corresponde aproximadamente a la misma etapa de diferenciación morfológica eritroblastos en una amplia variedad de modelos de ratón, se recomienda verificar la hora de examinar un modelo de ratón nuevo. Las células de cada uno de los subconjuntos de flujo cytometrically definidos deben ser ordenados y preparados citospina examinados para la estadificación morfológicas de eritroblastos.

Aunque el CD71/Ter119 subconjuntos cada uno contiene eritroblastos de la etapa de diferenciación similar, sigue existiendo un cierto grado de heterogeneidad dentro de cada subgrupo. En la primera aplicación del método CD71/Ter119, hemos dividido Ter119 + células en las regiones I a IV en función de su expresión CD71. Los límites precisos entre estas regiones se determinó arbitrariamente 4. Hemos añadido posteriormente información de la célula de tamaño con el análisis, en la forma de los parámetros de dispersión hacia adelante. Esto nos permitió dividir Ter119 células de alta en subgrupos, siguiendo los contornos naturales de la población 1 (Figura 1). Este planteamiento dio lugar a las poblaciones de maduración más uniforme y en resultados más reproducibles, y ha sido adaptado recientemente por otros investigadores 5,6,7. El subconjunto Erya puede subdividirse aún más cuando se desee 7. Un grupo sugirió el uso de CD44 en lugar de CD71 8. A pesar de CD44 es menos útil en la resolución de las primeras etapas eritroblastos, puede resolver subconjuntos después eritroblastos con más precisión. Ambos marcadores por lo tanto, se puede utilizar, o, alternativamente, su elección puede depender de los subconjuntos específicos de interés.

Una estrategia alternativa emplea imágenes multiespectrales utilizando la tecnología IMAGESTREAM (Amnis Corporation, Seattle, WA) 9. Que permite la adquisición simultánea y rápida de los datos morfológicos y de citometría de flujo, en miles de células. Es probable que se convertirá en el "estándar de oro" con respecto al análisis molecular de la etapa específica de eritroblastos, ya que los criterios morfológicos que se define la etapa de diferenciación se puede medir directamente. Sin embargo, en la actualidad esta tecnología es mucho menos generalizado que la citometría de flujo convencional, y adolece de dos problemas: no permite la clasificación de células, y se limita a un número menor de citometría de flujo de los parámetros.

Antígenos intracelulares

La detección de las proteínas intracelulares o BrdU requiere la fijación de las células y la permeabilización. La fijación precisa y el procedimiento de permeabilización depende del antígeno intracelular en cuestión. Usamos el LIVE / DEAD celular Se fija muertos Stain (Molecular Probes) durante el procedimiento de fijación, para distinguir viable de células muertas. Es de destacar que la permeabilización con detergentes generalmente afecta a la señal de Ter119, que es parcialmente soluble en detergente. Hemos superado esta dificultad mediante el uso de detergentes suaves (tales como la saponina basados ​​en "permanente / lavado 'buffer de BD Biosciences). También mancha por tanto antes de Ter119 y siguientes, el procedimiento de fijación y permeabilización, con el fin de optimizar la sig Ter119nal. Alternativamente, es posible clasificar las células viables de cada uno de los subconjuntos CD71 / Ter119 primero, y llevar a cabo la fijación y permeabilización por separado en las células purificadas de cada subgrupo (por ejemplo, véase el análisis del ciclo celular en el hígado fetal) 10.

Fetal subconjuntos hígado CD71/Ter119

El patrón de tinción CD71/Ter119 en el hígado fetal depende de la edad embrionaria 2 (Figura 3). Se subdivide las células fetales de hígado en 6 subgrupos, S0 a S5 10. En el inicio de la eritropoyesis definitiva en el hígado fetal en el día embrionario 11 (E11), las células se concentran en subgrupos S0 y S1, y son las células formadoras de colonias en gran parte eritroides (CFU-e). Con el desarrollo embrionario, CFU-e las células se diferencian en eritroblastos proeritroblastos y madurando y poco a poco llenar subconjuntos S2 a S5 (Figura 3).

S1 a S5 subconjuntos están compuestos casi en su totalidad de las células eritroides de la estirpe definitiva. Estos subconjuntos están ausentes en el EpoR - / - el hígado fetal. Un pequeño número de células Ter119 + en el hígado fetal se corresponden con el primitivo (saco vitelino) linaje eritroide. Estas células son evidentes en EpoR - / - el hígado fetal, donde no eritroblastos linaje surgen definitiva, pero por E13.5 forma menos del 1% de las células Ter119 + de tipo salvaje hígado fetal 10.

El subconjunto S0 es heterogénea. En E13.5, el 70% de S0 son células eritroides en la etapa de CFU-e, justo antes de la aparición de la dependencia EpoR 10. El resto son anteriores a los progenitores, así como las células de otros linajes hematopoyéticos, principalmente megacariocitos y macrófagos, estas células pueden ser ordenados o cerrada a 10 (Figura 3).

Interpretación de los cambios en la frecuencia de subconjuntos eritroides

Los cambios en la frecuencia de los subconjuntos eritroides deben interpretarse con cuidado. Un cambio en la frecuencia de las células en un determinado subconjunto puede ser debido a su tasa de apoptosis alterada, el tiempo altera el tránsito por ese subconjunto, o, alternativamente, puede ser debido a cambios en el número de células en otros subconjuntos. Una causa común de aumento de la frecuencia de los primeros eritroblasto subconjuntos ProE y Erya es el estrés eritropoyética de múltiples etiologías 1. Hallazgos similares se han observado en la década de 1960 mediante la inspección de las morfologías eritroblastos en la respuesta al estrés 11. La razón exacta para el aumento de la frecuencia relativa de los primeros precursores durante el estrés no está claro, pero en parte puede deberse a la mejoría en la supervivencia de estos precursores durante el estrés 1.

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Disclosures

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Massachusetts Medical School IACUC comité.

Acknowledgments

Damos las gracias a la base de citometría de flujo la Universidad de Massachusetts: Richard Konz, Giehl Ted, Gosselin Barbara, Gu Yuehua y Krupoch Tammy. Este trabajo fue financiado por NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) y NIH CA T32-130 807 (JRS). Los recursos básicos con el apoyo de la Diabetes Endocrinología del Centro de Investigación de subvención DK32520 también fueron utilizados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fas-biotin BD Biosciences 554256
Streptavidin-APC Molecular Probes, Life Technologies S868
40 μm sterile cell strainer Fisher Scientific 22363547
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining BD Biosciences 352008
U-bottom 96 well plate BD Biosciences 353910
ChromePure Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 015-000-003
CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) BD Biosciences 553266
Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) BD Biosciences 553673
7AAD BD Biosciences 559925
DAPI powder Roche Group 236276
FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 BD Biosciences 553848
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 BD Biosciences 553087
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 BD Biosciences 553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 BD Biosciences 553061
APC BrdU Flow kit BD Biosciences 557892
Annexin V-biotin BD Biosciences 556418

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología del Desarrollo número 54 de la eritropoyesis progenitores hematopoyéticos la citometría de flujo la eritropoyetina EpoR-/ - ratón el estrés eritropoyética la eritropoyesis fetal CD71 Ter119 el hígado fetal subconjuntos eritroides eritroblastos el ciclo celular
Identificación y análisis de los progenitores eritroides ratón usando el CD71/TER119 citometría de flujo ensayo
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Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., More

Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay. J. Vis. Exp. (54), e2809, doi:10.3791/2809 (2011).

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