Summary
Ett flöde-cytometrisk metod för identifiering och molekylär analys av differentiering-stegs-specifika murin erytroida progenitorer och prekursorer, direkt i nyskördade mus benmärg, mjälte eller lever hos foster. Analysen bygger på cellytan markörer CD71, Ter119 och cellstorlek.
Abstract
Studien av erytropoes syftar till att förstå hur röda blodkroppar bildas från tidigare hematopoetisk och erytroida stamceller. Specifikt är graden av röda blodkroppar bildas regleras av hormonet erytropoietin (EPO), vars syntes utlöses av hypoxi. Ett hot mot tillfredsställande resultat vävnad syresättning i en snabb ökning av Epo, köra en ökning erytropoetiska takt, en process som kallas erytropoetiska stress. Den resulterande ökningen av antalet cirkulerande röda blodkroppar förbättrar leveransen vävnad syre. En effektiv erytropoetisk stress är därför avgörande för överlevnad och återhämtning från fysiologiska och patologiska förhållanden såsom hög höjd, anemi, blödning, kemoterapi eller stamcellstransplantation.
Musen är en viktig modell för studiet av erytropoes och stress. Mus definitiva (vuxen-typ) erytropoes sker i fostrets lever mellan embryonala dagar 12,5 och 15,5, i neonatal mjälten, och hos vuxna mjälte och benmärg. Klassiska metoder för att identifiera erytroida stamceller i vävnad är beroende av förmågan hos dessa celler ger upphov till röda blodkroppar kolonier när pläterade i Epo innehåller halvfast media. Deras erytroida föregångare avkomma identifieras baseras på morfologiska kriterier. Ingen av dessa klassiska metoder ger tillgång till ett stort antal differentiering-stegs-specifika erytroida celler för molekylär studie. Här presenterar vi ett flöde-cytometrisk metod för att identifiera och studera differentiering-stegs-specifika erytroida progenitorer och prekursorer, direkt i samband med nyligen isolerade mus vävnad. Analysen bygger på cellytan markörer CD71, Ter119 och på flöde-cytometrisk "framåt-scatter" parameter, som är en funktion av cellens storlek. Den CD71/Ter119 analysen kan användas för att studera erytroida stamceller under sin reaktion på erytropoietiskt stressen in vivo, till exempel i anemic möss och möss inrymda i låga syreförhållanden. Det kan också användas för att studera erytroida stamceller direkt i vävnaderna av genetiskt modifierade vuxna möss eller embryon, för att bedöma den särskilda roll som den modifierade molekylärnivån i erytropoes.
Protocol
1. Skörd av vävnader
- Förbered rör som innehåller 2 till 5 ml kall färgning buffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med tillsats av 0,2% BSA och 5mm glukos). Håll rören på is innan vävnad skörd.
- Cull möss enligt lämpliga godkänt protokoll (t.ex. CO 2 inandning följt av halsdislokation).
- Dra blod från hjärtat till EDTA eller heparin blod-kollektionen rör för senare analys, t.ex. av hematokrit, retikulocyter eller CBC analys.
- Harvest mjälten och ben, placera vävnader från varje mus i ett separat rör, som bereddes i steg 1. Enkel åtkomst till mjälten är från vänster sida. För benmärg, skörda en eller båda lårben. Håll skördas vävnad på is.
- Om så önskas, väger mjälten. Möss som genomgår en erytropoetiska stress kommer sannolikt att visa en betydande ökning av mjälten vikt.
2. Beredning av mjältceller
- Med hjälp av en förfuktas 3 ml sprutan med kolven, tryck försiktigt mjälte, eller en del av mjälten (helst 0,1 gram eller mindre, motsvarande ungefär 10 8 celler) genom en 40 ìm steril cell sil (Fisherbrand katalognummer 22.363.547 eller annan) placeras på toppen av en 50 ml koniska rör. Håll röret på is under denna procedur. Tvätta cellerna genom silen med sammanlagt 2 ml färgning buffert.
- Försiktigt pipett den ansträngda cellsuspension för att bryta upp alla små klumpar. Om det behövs re-stam cellerna.
- Tvätta cellerna två gånger genom centrifugering och återsuspendera i kalla buffert.
- Räkna celler med en hemocytometer. Typiska avkastningen är 1-2 x 10 8 celler / mjälte. För flöde-Cytometry analys aliquote 1 till 2.000.000 celler per prov, antingen i FACS färgning rör (BD Falcon polystyren rundbottnad rör, 352.008) eller U-botten 96 brunnar (BD Falcon 353.910). Exempel färgning volym är 200 l, till en slutlig cellkoncentrationen 0,5 till 1 x 10 7 celler / ml eller 1-2 x 10 6 celler / 200 l prov.
3. Beredning av benmärg celler
- Förbered 1 eller 3 ml sprutor med bifogad 26G nål, förfylld med kall färgning buffert.
- Ta bort muskler fästa på lårbenet så att visualisera benet tydligt.
- Använda vassa kirurgisk sax, klipp av båda ändarna av lårbenet, så nära som möjligt till ändarna av benet. Detta bör avslöja ett litet hål i varje skär slutet, som leder in i benmärgen hålighet, som rinner genom längden på lårbenet.
- Med hjälp av förfyllda sprutor i steg 1 in nålen genom ett av dessa hål, och försiktigt spola benmärg ut genom hålet i andra änden, till ett rör.
- Skilja spolas cellerna under lätt pipettering, och sila genom ett 40 ìm sil som för mjälte ovan (se avsnitt 2.1).
- Tvätta cellerna två gånger genom centrifugering i kallt färgning buffert
- Räkna celler och återsuspendera i avsnitt 2.4. Typiska avkastningen är ca 10 7 celler per lårbenet.
4. Beredning av fetala leverceller
- För att förbereda tidsinställda-dräktiga möss, inrättat möss för parning på kvällen, att undersöka för vaginal pluggar före den 10 är den följande dag, den dag då den vaginala kontakten upptäcks betraktas dag 0,5. Veterinära personalen kanske kan hjälpa utredarna som är obekanta med denna teknik för att identifiera gravida kvinnor. Graviditet kan också bestämmas genom att övervaka musen vikt.
- Begränsad-dräktiga möss avlivas på dagar från 12,5 till 14,5 av graviditeten. Den livmoder hornen tas bort i en Petri-skål med iskallt odlingsmedium eller färgning buffert.
- Embryon bort från varje livmoder och fostrets lever dissekeras. En dissekera mikroskop krävs för embryonala dag 12,5 (E12.5) eller yngre.
- Lever kan skiljas mekaniskt genom att pipettera i buffert och behandlas antingen individuellt i 96 brunnar, eller sammanförs, beroende på experimentell krav.
- En lever hos foster vid E13.5 har ~ 10 7 celler. Cellerna tvättas två gånger i färgning buffert och återsuspenderade på 1-2 x 10 6 celler / 200 l prov för flödescytometrisk analys.
5. Antikropp färgning för flödescytometri
- Förbered en primär antikropp färgning pre-mix som ska användas för alla prover utom kontrollprover, som innehåller följande:
- ChromePure Kanin IgG (Jackson, 015-000-003) till en slutlig koncentration av 200μg/ml. Kontrollera beståndet koncentration på flaskan (det kan variera). Detta används för att blockera Fc-receptorer i musceller, alternativa arter som kan användas för detta är mus-IgG eller råtta IgG. Arter Valet avgörs av potentiella närvaro i färgningsprotokollet av sekundära antikroppar riktade mot primära rått / mus / kanin antikroppar, då dessa arter inte kan användaD som blockerar antikroppar. Alternativt kan 5% kaninserum också användas i stället för renat IgG. Ett annat alternativ är att använda monoklonala antikroppar eller fragment Fab riktad till musen Fc-receptorer. Den grundläggande protokollet nedan innehåller inga sekundära antikroppar och så IgG av någon av de tre arter kan användas.
- CD71-FITC, utspädd 1:200 (lager 0.5mg/ml, BD-Biosciences, 553.266)
- Ter119-PE, utspädd 1:200 (lager 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553.673)
- Eventuella ytterligare antikroppar riktade mot ytan epitoper av intresse, t.ex. antikroppar riktade mot Fas eller FasL (se 1,2). Blanda antikroppen lösningen försiktigt genom att vända röret 2-3 gånger.
- Tillsätt 200 ìl av pre-mix till varje cell prov och försiktigt återsuspendera cellerna.
- Förbered kontrollprover cell enligt följande:
- "Obehandlat": dessa celler finns kvar i färgning buffert och ger bakgrunden autofluorescens av cellerna.
- "Enda färg" kontroller: en sådan kontroll krävs för varje antikropp / färg som används i protokollet. Cellerna i dessa kontroller färgas antingen med en direkt konjugerad primära antikroppen, eller med både en primär antikropp och en konjugerad sekundär antikropp. Dessa kontroller används för att korrigera för spektral överlappning mellan kanalerna.
- "Fluorescens minus ett" (FMO) kontroller: en sådan kontroll krävs för varje antikropp / färg i protokollet: cellerna färgas med alla färger / antikroppar i protokollet med undantag för färgen / antikropp som detta är FMO kontroll. Den FMO kontroll för en viss kanal ger den sanna bakgrunden till den kanalen. Den kan omfatta icke-specifik antikropp av samma isotyp, och konjugerade med samma fluorescens märket som testet antikroppen (isotypisk kontroll).
- Inkubera prov och relevanta kontroller i den primära antikroppen fläcken på is 45 "till 1 timme i mörker (lägger locket aluminiumfolie på is-skopa).
- I slutet av inkubationstiden, tvätta cellerna genom att tillsätta 3 ml av färgning buffert i varje provrör och snurra för 3 "till 5" på cirka 400 xg vid 4 ° C. Om du använder 96 brunnar, tvätta cellerna tre gånger i en volym av 200 l.
- Om relevant, tillämpas sekundär antikropp fläcken. Applicera och tvätta som för första antikroppen fläcken.
- Om relevant, är en fläck med Annexin V tillämpas i slutet av inkubationen med hjälp av en Hepes buffert som i tillverkarens instruktioner. Detta fläcken är under 15 minuter vid rumstemperatur, eller i 1 timme på is.
- Celler är resuspenderas för flow-cytometry analys i färglösningen innehåller en cell-tätt DNA-färg, att utesluta döda celler. Flera DNA-färgämnen finns tillgängliga, inklusive propidiumjodid, 7-amino-actinomycin D (7AAD), eller DAPI. Valet bland dessa beror på tillgängliga kanaler, med tanke på de kanaler som tas upp till specifik antikropp färgning, och kanaler som finns på flow-cytometern. 7AAD fås från BD-Biosciences (559.925) och användas enligt tillverkarens anvisningar. För DAPI färgning, göra ett lager av 1mg/ml i dimetylformamid (DMF) från pulver (Roche, Cat # 236.276), håll vid -20 ° C, och späd 1:10,000 till 1:15,000 i färgning buffert.
6. Flow-cytometrisk sortering
- Celler är märkta med antikroppar mot CD71, Ter119, markörer härstamning, och en livskraft färgämne som beskrivs för flow-cytometrisk analys (avsnitt 5). Cellkoncentrationen under märkning får höjas till 5 x 10 7 / ml.
- Blanda en lika stor volym vardera av följande antikroppar för att göra mixen härstamning mästare:
- FITC Rat anti-mus-CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553.848
- FITC Rat anti-mus CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553.087
- FITC Hamster anti-mus CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553.061
- FITC Rat anti-mus CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557.396
- FITC Rat anti-mus-Ly-6G och Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553.126
- Använd Master Mix till 1:80 (Detta motsvarar 1:400 utspädning av varje antikropp aktier, som alla är 0,5 mg / ml).
- Använd lågt tryck sortering villkor och breda munstycken. För Aria (BD Biosciences) vi använder 100 μ munstycke, 20 psi tryck.
- Insamling buffert: PBS med tillsats av 20% fetalt bovint serum.
- För att kontrollera renhet på sorterat populationer, repris ett litet delprov från varje prov i en buffert som innehåller en livskraft färgämne (7AAD eller liknande).
7. Representativa resultat:
CD71/Ter119 färgning av vuxen benmärg eller mjälte identifierar ett utvecklande sekvens av fyra undergrupper, märkt ProE, EryA, EryB och EryC (figur 1) 1. Morfologiskt, dessa motsvarar alltmer mogna erytroblaster. Figur 1 illustrerar gating sekvensen vid dataanalys skede, vilket gör sig mycket liten händelse (inklusive kärnor, röda blodkroppar), aggregerade celler och döda celler.
Redovisning av proteiner på cellernas ytor kan mätas samtidigt för varje av dessa undergrupper, genom att lägga till relevanta antikropparna samtidigt som Ter119 och CD71 färgning. Figur 1 visar ett exempel på cellytan uttryck för dödens receptorn Fas 1. Denna mätning genomfördes på möss injicerades med Epo, eller kontroll möss injicerades med saltlösning. Det är uppenbart att Epo undertrycker Fas uttryck i EryA befolkningen in vivo 1.
Redovisning av intracellulära proteiner eller cellcykelns status kan också mätas för celler i varje rubrik. Figur 2 visar representativ analys cellcykeln av nyskördade benmärgsceller. Dessa mätningar kräver, utöver cellytan färgning med CD71 och Ter119, den fixering och permeabilization av celler för intracellulära märkning (se diskussion avsnitt).
I fostrets lever, är icke-erytroida celler first uteslutas genom gating på "Lin-" celler som är negativa för CD41, Mac-1, Gr-1, B220 och CD3 (Figur 3). Resterande celler är uppdelat i sex undergrupper, S0 till S5. Den exakta mönster av celler i fostrets lever är beroende av embryonala ålder (se diskussion avsnitt). En representant cellcykeln analys av S3 delmängd i E13.5 fetal lever visas (Figur 4).
Figur 1 CD71/Ter119 erytroida delmängder i musmjälte A. gating strategi:.. Mjältceller har bearbetats och märkt med antikroppar riktade mot CD71, Ter119 och Fas. Denna siffra visar analysen strategi efter den datainsamling steg. Histogram Jag visar alla förvärvade händelser. Den diagonala porten representerar händelser som sannolikt kommer att enstaka celler, med undantag för dubbletter eller större aggregat. Celler i denna port analyseras vidare i histogrammet II. Här mycket små händelser, troligen kärnor eller skräp, är undantagna. Den gated cellerna visas i histogrammet III, där DAPI-positiva celler, som sannolikt membran som släpper igenom apoptotiska celler, utesluts från vidare analys. Histogram IV visar den resulterande populationen av livskraftiga mjältceller. Den ProE porten innehåller CD71 hög Ter119 mellanliggande celler. Ter119 höga celler analyseras vidare i histogrammet V. Här CD71 höga celler är indelade i mindre mogna, stora "EryA" erytroblaster (CD71 hög Ter119 hög FSC hög) och mindre, mer mogna "EryB" erytroblaster (CD71 hög Ter119 hög FSC låg) . Den mest mogna erythroblast delmängd är EryC (CD71 låg Ter119 högt FSC låg). Histogram VI visar cellytan Fas uttryck, särskilt i EryA delmängden, hos möss i de basala tillstånd (injicerades med koksaltlösning), och möss injicerades med en engångsdos av Epo. Färgning med FAS antikroppar genomfördes samtidigt med CD71/Ter119 färgning. B. Cytospin preparat av celler sorteras från vardera av de angivna undergrupper. Cellerna färgades med Giemsa och med Diaminobenzidin, genererar den senare en brun fläck med hemoglobin. Cytospin uppgifter publicerades ursprungligen i Liu et al. Blood. Jul 2006 1, 108 (1) :123-33. Epub 2006 9 mars.
Figur 2. Cell cykel analys av CD71 hög Ter119 hög erytroblaster i benmärg från mus. Möss injiceras intraperitonealt med BrdU och mjälte eller benmärg skördades 30 till 60 minuter senare. Celler var fast och permeabilized och förutom att vara färgas för CD71 och Ter119, färgades för BrdU införlivas i deras replikera DNA med en monoklonal antikropp riktad till BrdU (fixering, permeabilization och BrdU-färgningsprotokollet var enligt tillverkaren). BrdU-positiva celler i S-fas av cykeln. Interphase celler BrdU-negativa och kan lösas in i G1 eller G2 / M faser, med hjälp av DNA-dye 7AAD.
Figur 3 CD71/Ter119 erytroida delmängder i mus lever hos foster A. gating strategi:.. Fetal leverceller var märkta för CD71, Ter119 och en cocktail av FITC-märkt antikroppar riktade till icke-erytroida härstamning markörer ("Lin"). Livsdugliga celler (7AAD-negativa) analyserades för Lin uttryck, och Lin-cellerna är indelade i S0 till S5 erytroida delmängder. Yngre är E13 lever hos foster som består av mindre mogna erytroblaster, som visas av frånvaron av celler i mogna S4/S5 delmängder. B. Cytospin preparat av celler sorteras från vardera av de angivna undergrupper. Cellerna färgades med Giemsa och med Diaminobenzidin, genererar den senare en brun fläck med hemoglobin. Cytospin uppgifterna ursprungligen published i Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484.
Figur 4. Cell cykel analys av fostrets lever erytroida delmängder. Dräktiga möss injicerades med BrdU och fostrets lever skördades 30 till 60 minuter senare, fast, permeabilized och färgat med antikroppar mot CD71, Ter119 och BrdU. Cellcykeln status S3 celler visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flödet-cytometrisk metoden tillåter samtidig undersökning av cellfunktioner som kan upptäckas med en fluorescens-konjugerad antikropp eller ligand, inklusive markörer cellytan, protein uttryck, cellöverlevnad, cellsignalering med fosfor-specifika antikroppar 3 och cellcykeln status. Dessa mätningar kan göras i varje ett antal differentiering steg specifika undergrupper, i samband med nyligen isolerade erytropoetisk vävnad. Denna metod gör därför bedömningen av funktionella och molekylära förändringar på olika nivåer av erytropoetiska systemet, som svar på en mängd olika erytropoetisk stimuli eller som ett resultat av genetiska mutationer.
Ingen antikropp utan korsreaktivitet och korsreaktivitet kan vävnadsspecifika. Det är därför viktigt att kontrollera, även för tidigare testats antikroppar, deras specificitet i samband med erytropoetiska vävnad, antingen med ett null eller knock-down cell modell.
Celler från specifika erytroida delmängder kan sorteras för RNA eller transkriptom analys. Sortera experiment bör använda låg sortering tryck och stora munstycken, för att minimera skjuvspänningen på cellerna. Vi rekommenderar att cellen renhet och livskraft efter varje sortering experiment. Notera i samband med flera parametrar flow-Cytometry, är den sanna bakgrunden för varje färg sin "FMO" kontroll (se 5.3), vilket inkluderar, förutom autofluorescens, bakgrunden på grund av spektral överlappning från alla andra färger. Vid analysen skede behöver en delmängd-specifik "FMO" kontroll som ska användas.
Differentiering skede av erytroblaster inom flödes-cytometrically definieras delmängder
Flödet-cytometrisk ProE / EryA / EryB / EryC delmängder definieras i termer av cellytan markör uttryck och Forward Scatter. Även om det är troligt att alla dessa undergrupper motsvarar ungefär samma morfologiska erythroblast differentiering steget i en mängd olika musmodeller, rekommenderar vi att du verifierar när man undersöker en ny musmodell. Celler från varje flödes-cytometrically definierade undergrupper bör sorteras och cytospin förberedelser undersöks för morfologiska iscensättning av erytroblaster.
Även om CD71/Ter119 delmängder innehåller vardera erytroblaster av liknande differentiering skede finns det fortfarande en viss grad av heterogenitet inom varje undergrupp. I den första tillämpningen av CD71/Ter119 metoden, delade vi Ter119 + celler i områden I-IV baserat på deras CD71 uttryck. Den exakta gränserna mellan dessa regioner bestämdes godtyckligt 4. Vi lade därefter information cellstorlek till analysen, i form av Forward Scatter parametern. Detta gjorde att vi kunde dela Ter119 höga celler in i undergrupper med följande naturliga befolkningen konturer 1 (Figur 1). Denna strategi resulterade i populationer av mer enhetlig mognad och i mer reproducerbara resultat, och har nyligen anpassats av andra utredare 5,6,7. Den EryA delmängd kan delas upp ytterligare om så önskas 7. En grupp föreslog användandet av CD44 i stället för CD71 8. Trots att CD44 är mindre användbara för att lösa tidigt erythroblast stadier, kan det lösa senare erythroblast undergrupper med större precision. Båda markörerna kan därför användas, alternativt kan deras val beror på de specifika delmängder av intresse.
En alternativ strategi sysselsätter multispektrala avbildning med ImageStream teknik (Amnis Corporation, Seattle, WA) 9. Det tillåter samtidig och snabb tillgång till både morfologiska och flöde-cytometrisk uppgifter om många tusen celler. Det är sannolikt att bli den "gyllene standard" med avseende på molekylär analys av fas-specifika erytroblaster, eftersom de morfologiska kriterier för differentiering skede definieras kan mätas direkt. Men för närvarande denna teknik är mindre allmänt tillgänglig än konventionell flödescytometri, och lider av två nackdelar: det tillåter inte att cellen sortering, och den är begränsad till ett mindre antal flow-cytometrisk parametrar.
Intracellulär antigen
Detektion av intracellulära proteiner eller BrdU kräver cellen fixering och permeabilization. Den exakta fixering och permeabilization förfarande baseras på den intracellulära antigen i fråga. Vi använder Live / Dead fastställbara Dead Cell Stain (molekylära sonder) under fixering förfarande, för att skilja livskraftiga från döda celler. Notera påverkan permeabilization med tvättmedel oftast Ter119 signal, som är delvis rengöringsmedel löslig. Vi övervinna denna svårighet genom att använda mjuka rengöringsmedel (t.ex. saponin-baserade "perm / tvätt" buffert från BD Biosciences). Vi bets också för Ter119 både före och efter, fixeringen & permeabilization förfarande, i syfte att optimera Ter119 SIGNAL. Alternativt är det möjligt att sortera livskraftiga celler från varje CD71 / Ter119 delmängder först, och utföra fixering och permeabilization separat på renat celler från varje rubrik (se t.ex. analysen cellcykeln i fostrets lever) 10.
Fostrets lever CD71/Ter119 delmängder
Den CD71/Ter119 färgningsmönster i fostrets lever är beroende av embryonala ålder 2 (Figur 3). Vi dela upp fetala leverceller i 6 undergrupper, S0 till S5 10. Vid början av definitiva erytropoes i fostrets lever på embryonala dag 11 (E11), celler koncentrerad delmängder S0 och S1 och är i stort sett erytroida kolonibildande celler (CFU-E). Med embryonala utveckling, CFU-E cellerna differentieras till proerythroblasts och mogna erytroblaster och gradvis fylla delmängder S2 till S5 (Figur 3).
Delmängder S1 till S5 består nästan helt av erytroida celler den slutgiltiga härstamning. Dessa delmängder är frånvarande i EpoR - / - lever hos foster. Ett litet antal Ter119 + celler i lever hos foster motsvarar de primitiva (gulesäcken) erytroida härstamning. Dessa celler är tydligt i EpoR - / - foster levern, där inga slutgiltiga härstamning erytroblaster uppstår, men genom E13.5 utgör mindre än 1% av Ter119 + celler i vildtyp lever hos foster 10.
S0 delmängden är heterogen. På E13.5, 70% av S0 celler erytroida celler vid CFU-e skede, strax före starten av EpoR beroende 10. Resten är tidigare stamceller samt celler från andra hematopoetiska härstamningar, främst megakaryocyter och makrofager, dessa celler kan sorteras eller gated 10 (Figur 3).
Tolkning av förändringar i frekvensen av erytroida delmängder
Förändringar i frekvens erytroida undergrupper ska tolkas med försiktighet. En förändring i frekvens av celler i en given delmängd kan bero på att deras förändrade apoptotiska takt, ändras transittiden genom den uppsättningen, eller alternativt kan bero på förändringar i antalet celler i andra undergrupper. En vanlig orsak till ökad frekvens av tidiga erythroblast delmängder ProE och EryA är erytropoetiska stress av flera etiologier 1. Liknande resultat har noterats under 1960-talet genom att inspektera erythroblast morfologier under stress 11. Den exakta orsaken till ökningen i den relativa frekvensen av tidigare prekursorer under stress är inte klart, men en del kan bero på den förbättrade överlevnaden av dessa prekursorer under stress 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive University of Massachusetts Medical School IACUC kommitté.
Acknowledgments
Vi tackar UMass kärnan flödescytometri: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu och Tammy Krupoch. Detta arbete har finansierats av NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) och NIH CA T32-130.807 (JRS). Kärna resurser som stöds av Diabetes Endokrinologi Research Center bevilja DK32520 användes också.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fas-biotin | BD Biosciences | 554256 | |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes, Life Technologies | S868 | |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352008 | |
| U-bottom 96 well plate | BD Biosciences | 353910 | |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD Biosciences | 553266 | |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD Biosciences | 553673 | |
| 7AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| DAPI powder | Roche Group | 236276 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Biosciences | 553848 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Biosciences | 553087 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Biosciences | 553126 | |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Biosciences | 553061 | |
| APC BrdU Flow kit | BD Biosciences | 557892 | |
| Annexin V-biotin | BD Biosciences | 556418 |
References
- Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
