Summary
안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM - MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
단백질을 측정 양적 assays에 대한 큰 필요가있다. 크게 quantitation의 황금 표준으로 간주 전통 샌드위치 immunoassays은, 높은 비용, 긴 리드 타임과 관련된, 그리고 단점 (예 : heterophilic 항체, autoantibody 간섭 '후크 효과')이 따른 다네입니다. 한 대체 기술 친화 농축집니다 양적 질량 분광법과 결합 펩티드의 일반적 SISCAPA (안티 펩타이드 항체에 의해 안정 동위 원소 표준 및 캡처)이라고도합니다.이 기법 2 다중 / 선택된 반응 모니터링 질량 분석법에 의해 안정 동위 원소 희석 및 검출과 펩티드의 선호도 강화가 ( SRM / MRM - MS)는 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공합니다. SRM / MRM - MS 잘 작은 분자 3, 4의 정확한 quantitation을 위해 설립되고 최근에는 플라즈마와 세포 lysates의 단백질의 농도를 측정하는 맞게되었습니다. 단백질의 quantitation를 달성하기 위해 5-7이 큰 분자로 소화 같은 트립신과 같은 효소를 사용하여 구성 요소 펩티드. 누구의 순서대로 해당 종의 대상 단백질 (예 : "proteotypic"펩티드)에 독특한 하나 이상 선택 펩티드는 다음 방지 펩티드 항체를 사용하여 샘플에서 농축하여 시료의 단백질 농도에 대한 정량 stoichiometric의 surrogates로 측정됩니다. 따라서, 안정 동위 원소 희석 (SID) 방법 (즉, 아군 인 펩타이드 표준 표시 안정 동위 원소), SRM / MRM 복잡한 생물 학적 매트릭스의 단백질 양을 정함 대한 surrogates로 proteotypic 펩티드의 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.을 결합 assays은 전통적인 immunoassays에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 시약은 생성하기 위해 상대적으로 저렴, analyte에 대한 특이성이 우수합니다, assays가 높은 멀티 플렉스 수, 농축은 깔끔한 플라즈마 (더 고갈 필요 없음)에서 수행하고, 기술은 단백질이나 수정의 다양한 의무가있다 할 수있다 자석 구슬 플랫폼에 맞게 본 동영상에 대한 관심. 8-13의 우리는 기본적인 프로토콜을 보여줍니다.
Protocol
실험 절차 :
분석은 합성 펩티드 및 안티 펩티드 항체가 필요합니다. 선택된 펩티드 관심의 단백질 고유, 8시 사이에 22 아미노산을 포함하고, 더 알려진 사후 translational 수정을해서는 안됩니다. 메티오닌 잔류물은 일반적으로 피할 및 이염 기성 아미노산 (예 : 주식, KR, RR)이있는 펩티드는 바람직하지입니다. 이 기법에 대한, 그것은 펩타이드의 C - 말단 (예 : K 또는 R은 표시)에서 아미노산을 레이블 (13 C, 15 N) 무거운 통합, 내부 표준으로 안정 동위 원소 분류 펩티드를 사용하는 것이 일반적입니다.
다음 프로토콜은 Epitomics 주식 회사 (버링게임, CA)과 뉴 잉글랜드 펩타이드 (가드너, MA)에서 합성 펩티드에서 얻은 방지 펩티드 항체를 사용하여 마우스 단백질 Osteopontin의 펩타이드 GDSLAYGLR를 측정하기 위해 개발된 분석을 설명합니다. 1) 펩티드 3 농축) 질량 분광법으로 분석 복잡한 단백질 혼합물, 2 트립신의 소화를) 프로토콜은 세 가지 주요 단계 (그림 1)으로 구성되어 있습니다. 이것은 마우스 Osteopontin 단백질과 아군 인간의 플라즈마 샘플을 시연한다.
1. 트립신 효소 소화 및 정리
- 서부 유럽 표준시 얼음 10 μL 깔끔한 플라즈마 나누어지는를 녹여.
- BCA 분석하여 총 단백질 농도를 결정하고 정지 고체를 제거하기 위해 시료를 원심 분리기.
- 자사의 스토리지 관에서 1000 μL 딥웰 플레이트와 피어스 가능한 필름으로 덮어 Pipet 10 μL 나누어지는.
- 각 샘플에 우레아 / 30mM dithiothreitol (DTT) (최종 농도 6M의 요소 / 20mM DTT) 신선한 9M 20 μL를 추가합니다.
- 37 30 분 품어 ° C.
- 각 샘플에 신선한 500 MM의 iodoacetamide (최종 IAM 50mM) 3 μL를 추가합니다.
- 상온에서 어두운 곳에 30 분 알을 품다.
- 100 MM 트리스 (산도 8) (~ 0.6M로 dilutes의 요소)의 257 μL를 추가합니다.
- 트립신 주식 솔루션 (; 기판 비율 1시 50분 효소 1 μg / μL) 10 μL를 추가합니다.
- 부화 37 ° C 야간 (12-16시간).
- 깔끔한 개미의 산성 (1 %의 최종 농도) 3 μL를 추가합니다.
- 안정 동위 원소 표준 (다중 분석을 수행, 일반적으로이 표준 isotopically - 분류 펩타이드 10 μL가 포함된 50-100 fmol에 관한 것이라면 여러 기준 추가) 추가합니다.
- 80 % acetonitrile, 폐기 흐름 통해 0.1 % 개미 산성 500 μL 잘 오아시스 카트리지 플레이트 씻으십시오. 이 3 번 반복합니다.
- 물에 0.1 % 개미 산성 500 μL를 추가하여 카트리지 판 평형과 흐름을 통해 폐기하십시오. 이 4 번 반복합니다.
- 카트리지 플레이트에 다이제스트 샘플을로드하고 흐름이 매우 느리게 때문에 진공을 조정합니다.
- 물에 0.1 % 개미 산성 500 μL로 씻어하고, 흐름을 통해 폐기하십시오. 이 3 번 반복합니다.
- 1000 μl 깊이 잘 플레이트에 80 % acetonitrile의 0.1 % 개미 산성 2 X 500 μL를 추가하여 Elute 펩티드는 (흐름을 통해 폐기하지 않음).
- 건조 (또는 speedvac) eluate를 Lyophilize. (Lyophilization이 선호하는 방법입니다)
- Reconstitute 50 μL PBS + 0.03 % 챕스을 추가하여 펩티드를 건조.
2. 펩타이드의 면역 친 화성의 농축
- 표준 킹피셔 96 잘 접시에 샘플을 전송합니다.
- 1 μg 항체와 표적 단백질 당 1.5 μL - G 코팅 자기 구슬을 (이것은 이전뿐만 아니라 비즈에 항체를 crosslink에게 옵션으로 제공됩니다) 추가합니다. 확인 구슬이 잘 흔들어 또는 vortexing으로 중지됩니다.
- 호일로 접시를 커버.
- 부드러운는 구슬이 정지되도록하는 텀블링와 (과 12~16시간) 밤새 품어.
- 포일 표면에서 어떤 액체를 제거하기 위해 5 초 동안 32 XG에 접시를 원심 분리기.
- 호일 커버를 제거합니다.
- 구슬의 세탁과 용출은 수동 또는 자동 방식으로 수행할 수 있습니다. 이 절차는 킹피셔 플랫폼에서 자동으로 단계를 설명합니다.
- 200 μL PBS + 0.03 % 챕스 (세척 당 일분)와 비즈에게 2 번 씻으십시오.
- PBS 200 μL 1시 10분 희석 + 0.03 % 챕스 (1 분)와 비즈 1 시간을 씻으십시오.
- 펩티드 5 % 초산 + 0.03 % 챕스 25 UL에 eluted 있습니다.
- 자석에 용출 플레이트를 삽입하고 남은 비즈를 전송하지를 돌보는 96 잘 접시에 eluate을 전송하기만하면됩니다.
- 실링 매트와 접시를 커버.
- eluate가 포함된 플레이트는 분석을 위해 세 quadrapole 질량 분석기로 전달됩니다.
3. 다중 반응 모니터링에 의해 분석 - 질량 분광법
- SRM / MRM 분석을위한 전환은 0.5 μL / 분 질량 분석기에 30% acetonitrile/0.1 % 개미 산성에서 펩타이드 표준의 microliter 솔루션 당 1 picomole을 일으키는 선정 및 최적화할 수 있습니다. 일단 안정 스프레이를 얻을 수 있습니다, MS / MS 스펙트럼을 수집합니다.
- 전환은 thre을 식별하여 MS / MS 스펙트럼에서 선택됩니다전자 약간의 노이즈가 스펙트럼의 영역에 풍부한 조각 이온. 번식 - 충전 펩타이드 이온 들어, Y 이온 조각 M /에서 감지 Z> 전구체 M / z는 일반적으로 SRM / MRM 분석 개발을위한 최선입니다. 그림 2 보여줍니다 476.3 MS / MS 스펙트럼 선택한 전환 이온> 508.3, 579.3 , 펩타이드 GDSLAYGLR에 대한 692.4 (무거운 안정 동위 원소 표준 481.3에 대한 전환이> 518.3, 589.3, 702.4 표시되지 않습니다.)
- 사용되는 질량 분석계의 제조 업체 및 모델에 따라 각 전환에 대해 최적화할 수 있습니다 여러 개의 매개 변수가 없습니다. 여기, 우리는 충돌 에너지를 올렸 및 신호의 수준을 모니터링하여 선택한 각 전환의 충돌 에너지를 최적화. 25 충돌 에너지는 각 전환에 대해 사용되었습니다.
- 다음과 같이 간단히, SRM / MRM 분석을위한 일반적인 구성은 다음과 같습니다 : 모바일 단계 (A) 0.1 % 개미 산성, (B) 90 % Acetonitrile / 0.1 % 개미 산성, 0.3 X 5mm C18 트랩 열, 75 μm의 ID를 X 15cm C18 분석 열 (Reprosil - PUR C18 AQ, 120 A · 기공). 주사 량은 10 μL이며, 샘플은 총 유량에서 3 %의 B에서 5 분 장전 3 μL / 분 및 3 선형 그라데이션으로 eluted - 300에서 45 % B - 10 분 400 NL / 분. 4000 QTRAP (ABSCIEX, 포스터 시티, CA)에 조건이 스프레이 전압 2.3kV, 이온 소스 온도 150 ° C했다, 12의 GS1, 그리고 커튼 가스 15.
- 샘플은 샘플의 10 μL를 주입하여 SRM / MRM 의해 분석됩니다. 피크 영역은 프로그램 스카이 라인을 사용하여 빛과 무거운 펩티드를 위해 통합되어 있습니다. 14이 경우, 배경 잡음 무료입니다 가장 풍부한 전환을 사용하여 각 샘플에 레이블이 지정되지 않은 / 레이블 펩타이드의 최고 지역 비율 (PAR), Y5 전환을 계산 (가벼운 펩티드 476.3> 579.3, 무거운 표준 펩티드 481.3> 589.3).
4. 대표 결과 :
측정된 피크 면적 비율 (아군 무거운 isotopically - 표시 펩타이드에 가벼운 내생 펩타이드의 상대)는 대상 펩타이드의 양적 측정을 제공합니다. 그림 3 SISCAPA - 풍부한 샘플의 빛과 무거운 펩티드의 예제 크로마토 그램을 보여줍니다. 동시에 여러 전환에 elute 가볍고 무거운 펩티드가 신원을 확인하여 각 펩타이드에 대해 모니터링할 수 수 있습니다.
SISCAPA 과정을 그림 1. 도식 개요. 복잡한 단백질 혼합물은 펩티드로 소화합니다. 타겟 펩티드 analytes는 (내생 analyte과 아군 안정 동위 원소 - 라벨이 내부 표준) 단백질 G - 코팅 자성 입자에 고정화 방지 펩티드 항체를 사용하여 풍부하게하고 있습니다. 절연 다음, 대상 펩티드는 자성 입자에서 eluted되고 내부 표준에 상대적으로 quantitation에 대한 질량 분광법으로 분석했다.
그림 2. SRM / MRM 변환 세 조각의 선택을 보여주는 펩타이드 GDSLAYGLR의 MS / MS 스펙트럼.
그림 3. 가벼운 펩티드 analyte의 최고 프로필 (빨간색)와 무거운 안정 동위 원소 - 라벨 내부 표준 (파란색)을 보여주는 예제 chromatograms. 그들은 크로마 토그래피 시스템에서 elute으로 가벼운 펩티드 (476.3> 579.3)와 라벨 무거운 동위 원소에서 안정 Y5 전환 Chromatograms는 표준 (481.3> 589.3) 시간이 지남에 따라 꾸몄다 있습니다.
Discussion
로 설명한 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 구슬이 부화 기간 동안 잘 혼합 남아 보장합니다. 구슬이 잘 / 유리병의 바닥에 정착 수 있도록하는 것은 다양성을 증가 발생합니다. 또한 중요하기 잠복기 다음 잘 / 유리병의 상단에 남아있을 수있는 액체 다운 스핀. 재현성 트립신의 소화도 중요합니다. 그러나, 그것은 소화의 가능성이 다른 방법이 대상 단백질의 주어진 집합에 대한 최적화할 수 있습니다 무료로 항체의 15 용리가의 검색을 방해하지 않는다;. 소화에 대한 절차는 SISCAPA와 함께 우리의 연구실에 광범위하게 활용되어 여기에서 설명한 항체가 나중에 펩티드보다 열 또는 elutes에서 제외되어 있지만 항체가 이전에 대규모 실험 또는 무료 항체 경우 친화 농축에 단백질 G 비즈에 가교 될 수 있기 때문에 가능성이 펩티드는 문제가된다. 우리는 또한 잔여 구슬이나 입자를 제거하는 예제 autosampler에 접시뿐만 아니라 흐름의 반대 방향으로 트랩 열을 씻는 아래 자석을 (로딩에 비해) 장소에 유용하게 나타났습니다. 설명 마그네틱 비드 접근뿐만 아니라, 기술도 칼럼 형식 (즉, 친화 크로마 토그래피)에 적용할 수 있습니다. 12, 16
사용자가 전체 프로토콜과 함께 편안한되면, 기술은 또한 전체적인 분석을 강화 몇 가지 수정 의무가 있습니다. 우선 11, 그것이 강화 단계 (즉 멀티플렉싱)에 항체를 결합하여 하나의 분석에서 여러 analytes를 분석 할 수 있습니다. 질량 분석계는 동시에 analytes 다수의 분석이 가능합니다. 둘째, 원래의 샘플의 볼륨을 증가하는 것은 분석의 감도를 향상시킵니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NCI 임상 Proteomic 기술 평가 센터 (CPTAC) 부여 (# U24 CA126476)뿐만 아니라 엔터테인먼트 산업 재단 (EIF)과 EIF 여성 암 연구 기금에서 유방암 Biomarker 디스커버리 컨소시엄에 부여로 투자하고,되었다 켁 재단 카나리 재단, 그리고 폴 G. 알렌 가족 재단에서 후한 선물.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 | |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 | |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Foil cover for 96 well plate | Excel Scientific | 12-169 | |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| Table 1: Materials | |||
| Urea | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "no-weigh dithiothreitol" |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| Formic acid | EMD Millipore | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Table 2: Reagents | |||
| 100 mM Tris pH 8 | |||
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Stable isotope standard mastermix | |||
| Anti-peptide antibody mastermix | |||
| Table 3: Solutions to be prepared | |||
References
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