Summary
स्थिर आइसोटोप मानक और विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी (SISCAPA) जोड़े स्थिर आइसोटोप कमजोर पड़ने मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MRM एमएस) के साथ पेप्टाइड्स उनके संबंधित प्रोटीन के लिए surrogates के रूप में पेप्टाइड्स के मात्रात्मक माप प्रदान की आत्मीयता संवर्धन द्वारा कैप्चर. यहाँ हम एक आंशिक रूप से स्वचालित प्रारूप में चुंबकीय कणों का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन.
Protocol
प्रायोगिक प्रक्रिया:
परख सिंथेटिक पेप्टाइड्स और विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी की आवश्यकता है. चयनित पेप्टाइड्स ब्याज की प्रोटीन के लिए अद्वितीय हो सकता है, के बीच 8 और 22 एमिनो एसिड होते हैं चाहिए, और कोई ज्ञात बाद translational संशोधनों है. Methionine अवशेषों को आम तौर पर परहेज कर रहे हैं और dibasic अमीनो एसिड (जैसे के.के., के.आर., आरआर) से युक्त पेप्टाइड्स अवांछनीय हैं. इस तकनीक के लिए, यह आम है आंतरिक मानकों के रूप में स्थिर आइसोटोप लेबल पेप्टाइड्स का उपयोग, भारी शामिल (13 सी और एन 15) अमीनो एसिड पेप्टाइड (लेबल यानी कश्मीर या अनुसंधान) सी टर्मिनस पर लेबल.
निम्नलिखित एक माउस प्रोटीन osteopontin से पेप्टाइड GDSLAYGLR उपाय, Epitomics (Burlingame, CA) इंक और न्यू इंग्लैंड पेप्टाइड (गार्डनर, एमए) से सिंथेटिक पेप्टाइड्स से प्राप्त विरोधी पेप्टाइड एंटीबॉडी का उपयोग कर विकसित परख प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. 1) के trypsin पाचन जटिल प्रोटीन मिश्रण, 2) 3 पेप्टाइड्स के संवर्धन) मास स्पेक्ट्रोमेट्री से विश्लेषण: प्रोटोकॉल तीन मुख्य चरणों (चित्रा 1) के होते हैं. यह एक मानव प्लाज्मा माउस osteopontin प्रोटीन के साथ बालीदार नमूना पर प्रदर्शन किया जाएगा.
1. Trypsin enzymatic पाचन और सफाई
- 10 μL गीला बर्फ पर स्वच्छ प्लाज्मा विभाज्य पहले गला लें.
- बीसीए परख द्वारा कुल प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण और नमूना अपकेंद्रित्र के लिए किसी भी निलंबित ठोस हटाने.
- Pipet इसके भंडारण ट्यूब से 10 एक 1000 μL deepwell थाली और पियर्स में सक्षम फिल्म के साथ कवर μL विभाज्य.
- प्रत्येक नमूने के ताजा यूरिया / 30mm (डीटीटी) dithiothreitol (अंतिम एकाग्रता 6M डीटीटी / यूरिया 20mm) 9M 20 μL जोड़ें.
- 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- प्रत्येक नमूने के ताजा 500 मिमी iodoacetamide (अंतिम IAM 50mm) के 3 μL जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- 100 मिमी (8 पीएच) Tris (dilutes 0.6M ~ यूरिया) के 257 μL जोड़ें.
- Trypsin शेयर समाधान (: सब्सट्रेट अनुपात 1:50 एंजाइम के लिए 1 μg / μL) के 10 μL जोड़ें.
- 37 सेते ° C रातोंरात (12-16 घंटे).
- साफ चींटी एसिड (1% की अंतिम एकाग्रता) के 3 μL जोड़ें.
- स्थिर आइसोटोप मानक (एकाधिक मानकों जोड़ रहे हैं अगर एक मल्टिप्लेक्स परख प्रदर्शन, आमतौर पर यह 10 μL युक्त मानक isotopically लेबल पेप्टाइड का 50-100 fmol के बारे में है) में जोड़ें.
- ओएसिस कारतूस प्लेट अच्छी तरह से धो 80% acetonitrile, प्रवाह के माध्यम से discarding में 500 0.1% चींटी एसिड की μL के साथ. इस 3 बार दोहराएँ.
- पानी में 0.1% चींटी एसिड के 500 μL जोड़कर कारतूस थाली संतुलित करना, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. इस 4 बार दोहराएँ.
- कारतूस थाली को पचाने नमूने लोड और वैक्यूम समायोजित इतना प्रवाह बहुत धीमी गति से है.
- पानी में 0.1% चींटी एसिड के 500 μL के साथ धो, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. इस 3 बार दोहराएँ.
- 1000 μl गहरे अच्छी तरह से थाली में 80% acetonitrile में 0.1% चींटी एसिड के 2 x 500 μL जोड़कर Elute पेप्टाइड्स (प्रवाह के माध्यम से अलग नहीं है).
- (या speedvac) सूखापन eluate Lyophilize. (Lyophilization पसंदीदा तरीका है)
- Reconstitute 50 μL पीबीएस + 0.03% chaps जोड़कर पेप्टाइड्स सूख गया.
2. पेप्टाइड immunoaffinity संवर्धन
- मानक किंगफिशर 96 प्लेटें अच्छी तरह से करने के लिए नमूना हस्तांतरण.
- 1 μg एंटीबॉडी और 1.5 μL लक्ष्य के प्रति प्रोटीन जी लेपित चुंबकीय मोतियों (यह वैकल्पिक है मोती के लिए एंटीबॉडी अलावा पूर्व crosslink) जोड़ें. सुनिश्चित मनकों को अच्छी तरह से मिलाते या vortexing द्वारा निलंबित कर रहे हैं.
- कवर पन्नी के साथ थाली.
- रातोंरात कोमल सुनिश्चित मोती निलंबित कर रहे हैं tumbling के साथ (12-16 घंटे) सेते हैं.
- अपकेंद्रित्र 5 सेकंड के लिए 32 XG पर थाली पन्नी सतह से कोई भी तरल निकालने.
- पन्नी कवर निकालें.
- और मोतियों की धुलाई elution मैन्युअल रूप से या एक स्वचालित फैशन में किया जा सकता है. यह प्रक्रिया एक किंगफिशर मंच पर स्वचालित कदम का वर्णन करता है.
- मोती 200 μL पीबीएस + 0.03% chaps (धो प्रति 1 मिनट) के साथ 2 बार धो लें.
- मोती 200 पीबीएस की μL 1:10 कमजोर पड़ने + 0.03% chaps (1 मिनट) के साथ 1 बार धोएं.
- पेप्टाइड्स 5% एसिटिक एसिड + 0.03% chaps के 25 उल में eluted कर रहे हैं.
- एक चुंबक पर elution थाली प्लेस और एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए eluate हस्तांतरण, ध्यान लेने के बचे हुए मोती स्थानांतरण नहीं.
- कवर एक सील चटाई के साथ थाली.
- eluate युक्त थाली ट्रिपल विश्लेषण के लिए quadrapole मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए दिया है.
3. एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी द्वारा विश्लेषण - मास स्पेक्ट्रोमेट्री
- SRM / MRM विश्लेषण के लिए संक्रमण और चयनित किया जा सकता है / μL मिनट पर 0.5 मास स्पेक्ट्रोमीटर में 30% acetonitrile/0.1% चींटी एसिड पेप्टाइड मानक के microliter समाधान के प्रति एक 1 picomole infusing द्वारा अनुकूलित. एक बार स्थिर स्प्रे प्राप्त है, एक एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम इकट्ठा.
- संक्रमण एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम से thre की पहचान के द्वारा चयनित हैंई थोड़ा शोर के साथ स्पेक्ट्रम के क्षेत्र में प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयनों. गुणा चार्ज पेप्टाइड आयनों के लिए m / y-आयन टुकड़े पाया z> अग्रदूत मी / z आम तौर पर कर रहे हैं / SRM MRM परख विकास के लिए सबसे अच्छा चित्रा 2 से पता चलता है स्पेक्ट्रम एमएस / एमएस और चयनित संक्रमण आयनों> 476.3 579.3 508.3, , पेप्टाइड GDSLAYGLR के लिए (भारी स्थिर आइसोटोप 481.3 मानक के लिए बदलाव नहीं पता चला> 518.3, 589.3, 702.4) 692.4.
- और मास स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग किया जाता मॉडल पर निर्भर करता है, वहाँ कई मापदंडों कि प्रत्येक संक्रमण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है है कर रहे हैं. यहाँ, हम टक्कर ऊर्जा ramping और संकेत के स्तर की निगरानी के द्वारा प्रत्येक चयनित संक्रमण की टक्कर ऊर्जा अनुकूलित. 25 के एक टक्कर ऊर्जा प्रत्येक संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- संक्षेप में, एस आर एम / MRM विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट विन्यास के रूप में इस प्रकार है: मोबाइल चरण (एक) 0.1% चींटी एसिड, (बी) 90% Acetonitrile / 0.1% चींटी एसिड, 0.3 x 5 मिमी C18 जाल स्तंभ, 75 सुक्ष्ममापी आईडी x 15 सेमी C18 विश्लेषणात्मक स्तंभ (Reprosil - पुर C18 AQ, 120 ° ताकना). इंजेक्शन की मात्रा 10 μL है और नमूना कुल प्रवाह दर पर 3% बी पर 5 मिनट के लिए भरी हुई है μL 3 / मिनट और 3 से एक रेखीय ढाल से eluted - 300 पर 45% बी - 10 मिनट में 400 nl / मिनट. एक 4000 QTRAP (ABSCIEX, फोस्टर शहर, सीए) पर स्थितियां स्प्रे वोल्टेज 2.3kV, आयन स्रोत तापमान 150 डिग्री सेल्सियस, 12 की GS1 और पर्दे गैस 15.
- नमूना SRM / MRM द्वारा नमूना के 10 μL इंजेक्शन लगाने के द्वारा विश्लेषण किया है. पीक क्षेत्रों प्रकाश और भारी कार्यक्रम क्षितिज का उपयोग पेप्टाइड्स के लिए एकीकृत कर रहे हैं प्रत्येक नमूने में unlabeled / लेबल पेप्टाइड सबसे प्रचुर मात्रा में संक्रमण है कि इस मामले में पृष्ठभूमि शोर से मुक्त है, का उपयोग कर के 14 चोटी क्षेत्र अनुपात (PAR) y5 संक्रमण की गणना. (प्रकाश पेप्टाइड 476.3 579.3>, भारी मानक पेप्टाइड 481.3 589.3>).
4. प्रतिनिधि परिणाम:
मापाकरे चोटी क्षेत्र अनुपात (प्रकाश अंतर्जात पेप्टाइड बालीदार भारी isotopically लेबल पेप्टाइड के सापेक्ष) लक्ष्य पेप्टाइड का एक मात्रात्मक उपाय प्रदान चित्रा 3 SISCAPA समृद्ध एक नमूना में प्रकाश और भारी पेप्टाइड्स के एक उदाहरण chromatogram से पता चलता है. ध्यान दें कि एक ही समय में और कई बदलाव पर प्रकाश और भारी elute पेप्टाइड्स प्रत्येक पेप्टाइड करने के लिए पहचान की पुष्टि के लिए नजर रखी जा सकती है.
चित्रा 1. SISCAPA प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन. एक जटिल प्रोटीन मिश्रण पेप्टाइड में पचता है. लक्षित पेप्टाइड analytes (अंतर्जात analyte और नुकीला एक स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक) विरोधी पेप्टाइड जी लेपित चुंबकीय कणों प्रोटीन पर immobilized एंटीबॉडी का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं. अलगाव के बाद, लक्षित पेप्टाइड्स चुंबकीय कणों से eluted हैं और quantitation के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री आंतरिक मानक के सापेक्ष द्वारा विश्लेषण.
चित्रा 2. पेप्टाइड SRM / MRM संक्रमण के लिए तीन टुकड़े का चयन दिखा GDSLAYGLR एमएस / एमएस के स्पेक्ट्रम .
चित्रा 3 उदाहरण chromatograms एक प्रकाश पेप्टाइड analyte के शिखर प्रोफ़ाइल (लाल) और भारी स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक (नीला) दिखा. Chromatograms प्रकाश पेप्टाइड (476.3 579.3>) और भारी स्थिर आइसोटोप लेबल से y5 संक्रमण के लिए मानक (481.3 589.3>) समय पर प्लॉट किए जाते हैं के रूप में वे क्रोमैटोग्राफी प्रणाली से elute.
Discussion
के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम सुनिश्चित करने के मोती ऊष्मायन अवधि के दौरान अच्छी तरह से मिश्रित रहते हैं. मोती अच्छी तरह / शीशी के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दे परिवर्तनशीलता में वृद्धि हुई है परिणाम होगा. यह भी महत्वपूर्ण है किसी भी तरल है कि अच्छी तरह / शीशी के ऊष्मायन अवधि के बाद शीर्ष पर रह सकता है नीचे स्पिन. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य trypsin पाचन भी महत्वपूर्ण है. पाचन के लिए प्रक्रिया यहाँ वर्णित हमारी प्रयोगशाला में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया SISCAPA के साथ संयोजन के रूप में, तथापि, यह पाचन की संभावना वैकल्पिक तरीकों लक्ष्य प्रोटीन का एक दिया सेट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है मुक्त एंटीबॉडी के 15 Elution का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. पेप्टाइड, संभावना है क्योंकि एंटीबॉडी स्तंभ या elutes पेप्टाइड्स की तुलना में बाद से बाहर रखा गया है, लेकिन एंटीबॉडी प्रोटीन जी मोती Crosslinked प्रयोगों में बड़े या यदि मुक्त एंटीबॉडी आत्मीयता संवर्धन करने से पहले किया जा सकता है एक समस्या बन जाता है. हम भी यह autosampler पर नमूना थाली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रवाह के विपरीत दिशा में जाल स्तंभ धोने के नीचे एक चुंबक (लोडिंग करने के लिए तुलना में) जगह के लिए किसी भी अवशिष्ट मोती या कणों को दूर करने के लिए उपयोगी पाया है. चुंबकीय मनका दृष्टिकोण वर्णित के अलावा, तकनीक भी एक स्तंभ स्वरूप (यानी आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है 12, 16 .
एक बार उपयोगकर्ता समग्र प्रोटोकॉल के साथ सहज है, तकनीक भी कई संशोधनों कि समग्र परख बढ़ाने के लिए उत्तरदायी 11 सबसे पहले, यह संभव है एक ही परख में संवर्धन कदम (यानी बहुसंकेतन) में एंटीबॉडी के संयोजन के द्वारा एकाधिक analytes विश्लेषण . मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ ही analytes की बड़ी संख्या का विश्लेषण करने में सक्षम है. दूसरा, मूल नमूना की मात्रा में वृद्धि परख की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम NCI नैदानिक प्रोटिओमिक प्रौद्योगिकी आकलन केंद्र (CPTAC) अनुदान (# CA126476 U24) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मनोरंजन उद्योग (EIF) फाउंडेशन और EIF महिला के कैंसर रिसर्च फंड से स्तन कैंसर biomarker खोज कंसोर्टियम के लिए एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और उबकना फाउंडेशन, कैनरी फाउंडेशन, और पॉल एलन जी परिवार फाउंडेशन से उदार उपहार.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 | |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 | |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Foil cover for 96 well plate | Excel Scientific | 12-169 | |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| Table 1: Materials | |||
| Urea | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "no-weigh dithiothreitol" |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| Formic acid | EMD Millipore | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Table 2: Reagents | |||
| 100 mM Tris pH 8 | |||
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Stable isotope standard mastermix | |||
| Anti-peptide antibody mastermix | |||
| Table 3: Solutions to be prepared | |||
References
- Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).
- Anderson, N. L. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).
- Chace, D. H., Kalas, T. A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).
- Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).
- Barr, J. R. Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).
- Kuhn, E. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).
- Whiteaker, J. R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).
- Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).
- Kuhn, E. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
- Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).
- Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
- Ackermann, B. L., Berna, M. J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).
- MacLean, B. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Proc, J. L. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
- Berna, M. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).
