Summary
Standard di isotopi stabili e cattura da anticorpi anti-peptide (SISCAPA) affinità arricchimento coppie di peptidi con diluizione degli isotopi stabili e spettrometria di massa (MRM-MS) per fornire la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. Qui descriviamo il protocollo utilizzando particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato.
Abstract
C'è un grande bisogno di analisi quantitative per la misurazione delle proteine. Immunodosaggi panino tradizionale, in gran parte considerato il gold standard nella quantificazione, sono associati ad un alto costo, tempi lunghi, e sono piene di inconvenienti (ad esempio gli anticorpi eterofili, le interferenze di autoanticorpi, 'gancio-effetto') 1. Una tecnica alternativa è l'arricchimento affinità di peptidi accoppiata con spettrometria di massa quantitativa, comunemente indicata come SISCAPA (norme isotopo stabile e Capture da anticorpi anti-peptide). 2 In questa tecnica, l'arricchimento affinità di peptidi con la diluizione degli isotopi stabili e il rilevamento da parte selezionato / spettrometria di massa di reazione più di monitoraggio ( SRM / MRM-MS) fornisce la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. SRM / MRM-MS è ben definito per la quantificazione accurata di piccole molecole 3, 4 e più recentemente è stato adattato per misurare le concentrazioni di proteine nel plasma e lisati cellulari. 5-7 Per ottenere la quantificazione delle proteine, le molecole più grandi sono digeriti a peptidi componente utilizzando un enzima come la tripsina. Uno o più peptidi selezionati la cui sequenza è unica per la proteina bersaglio in questa specie (cioè "proteotypic" peptidi) vengono poi arricchite dal campione utilizzando anticorpi anti-peptide e misurato come surrogati stechiometrico quantitativa per la concentrazione di proteine nel campione. Quindi, insieme alla diluizione degli isotopi stabili (SID) metodi (cioè un spillo in isotopi stabili etichettati peptide standard), SRM / MRM può essere usato per misurare le concentrazioni di peptidi proteotypic come surrogati per la quantificazione delle proteine in matrici biologiche complesse. I saggi hanno diversi vantaggi rispetto ai tradizionali saggi immunologici. I reagenti sono relativamente meno costosi da produrre, la specificità per l'analita è eccellente, il test può essere altamente multiplex, l'arricchimento può essere effettuato dal plasma pulito (senza esaurimento richiesto), e la tecnica è suscettibile di una vasta gamma di proteine o modifiche di interesse. 8-13 In questo video si dimostra il protocollo di base adattata ad una piattaforma magnetica tallone.
Protocol
Procedura sperimentale:
Il test richiede peptidi sintetici e di anticorpi anti-peptide. Peptidi selezionato dovrebbe essere univoco per la proteina di interesse, contengono tra 8 e 22 amminoacidi, e non hanno conosciuto modificazioni post-traduzionali. Residui di metionina sono generalmente evitate ed i peptidi contenenti dibasico aminoacidi (es. KK, KR, RR) sono indesiderabili. Per questa tecnica, è comune utilizzare peptidi isotopo stabile etichettati come standard interni, incorporando pesante (13 C e 15 N) etichettati aminoacidi al C-terminale del peptide (cioè K o R etichettati).
Il protocollo che segue descrive un test sviluppato per misurare il peptide GDSLAYGLR dal osteopontina proteina del mouse, utilizzando anticorpi anti-peptide ottenuto da Epitomics Inc. (Burlingame, CA) e peptidi sintetici dal New England Peptide (Gardner, MA). Il protocollo si compone di tre fasi principali (Figura 1): 1) la digestione della tripsina della miscela proteica complessa, 2) Arricchimento dei peptidi 3) Analisi mediante spettrometria di massa. Sarà dimostrato su un campione di plasma umano a spillo con la proteina osteopontina mouse.
1. Tripsina digestione enzimatica e pulizia
- Scongelare aliquota 10 microlitri plasma pulito in ghiaccio umido.
- Determinare la concentrazione totale delle proteine con il saggio BCA e centrifugare il campione per rimuovere eventuali particelle solide in sospensione.
- Pipettare un'aliquota 10 microlitri dal suo tubo di stoccaggio a un piatto di 1000 ml Deepwell e coprire con pellicola in grado di perforare-.
- Aggiungere 20 ml di 9M fresca urea / 30mm ditiotreitolo (DTT) (finale 6M concentrazione di urea / 20 mM DTT) per ogni campione.
- Incubare per 30 minuti a 37 ° C.
- Aggiungere 3 ml di fresca 500 Iodoacetamide mM (finale IAM 50mm) per ogni campione.
- Incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
- Aggiungere 257 ml di 100 mM Tris (pH 8) (urea diluisce a ~ 0.6M).
- Aggiungere 10 ml di soluzione madre tripsina (1 mg / mL; per 1:50 enzima: rapporto di substrato).
- Incubare a 37 ° C durante la notte (12-16 ore).
- Aggiungere 3 ml di acido formico pulito (concentrazione finale di 1%).
- Aggiungi standard di isotopi stabili (standard vengono aggiunti se si esegue un test multiplex, di solito si tratta di 10 L contenente 50-100 fmol di standard peptide isotopi marcati).
- Lavare la piastra cartuccia Oasis bene con 500 microlitri di 0.1% di acido formico in 80% acetonitrile, scartando la flow-through. Ripetere questa operazione 3 volte.
- Equilibrare la piastra della cartuccia con l'aggiunta di 500 microlitri di 0.1% di acido formico in acqua, ed eliminare la flow-through. Ripetere questa operazione 4 volte.
- Carico campioni digerire alla piastra della cartuccia e regolare il vuoto in modo che il flusso è molto lento.
- Lavare con 500 microlitri di 0.1% di acido formico in acqua, ed eliminare flow-through. Ripetere questa operazione 3 volte.
- Peptidi eluire con l'aggiunta di 2 x 500 microlitri di 0.1% di acido formico in 80% acetonitrile in 1000 ml profondi pozzetti (non scartare la flow-through).
- Liofilizzare (o speedvac) l'eluato a secchezza. (Liofilizzazione è il metodo preferito)
- Ricostituire secca peptidi aggiungendo 50 microlitri di PBS + 0,03% CHAPS.
2. Peptide immunoaffinità arricchimento
- Trasferire il campione standard di Kingfisher Piastre a 96 pozzetti.
- Aggiungere 1 anticorpi mg e 1,5 microlitri proteina-G perle rivestito magnetiche per bersaglio (è facoltativo crosslink l'anticorpo ai talloni prima dell'aggiunta). Garantire perle sono ben sospesa agitazione o vortex.
- Coprire la piastra con un foglio.
- Incubare per una notte (12-16 ore) con dolci cadendo per assicurare perle sono sospesi.
- Centrifugare piastra a 32 xg per 5 secondi per rimuovere il liquido dalla superficie del foglio.
- Togliere il coperchio di alluminio.
- Lavaggio e l'eluizione delle perline può essere eseguita manualmente o in modo automatico. Questa procedura descrive le operazioni automatizzate su una piattaforma Kingfisher.
- Lavare le perle 2 volte con 200 ul PBS + 0,03% CHAPS (1 minuto a lavaggio).
- Lavare le perle 1 volta con 200 microlitri diluizione 1:10 di PBS + 0,03% CHAPS (1 minuto).
- I peptidi sono eluiti in 25 uL del 5% di acido acetico + 0,03% CHAPS.
- Posizionare la piastra eluizione su un magnete e trasferire l'eluato sino ad una piastra da 96 pozzetti, facendo attenzione a non trasferire le perline avanzi.
- Coprire la piastra con un tappeto di tenuta.
- La piastra contenente l'eluato viene consegnato allo spettrometro di massa a triplo quadrapole per l'analisi.
3. Analisi per il monitoraggio di reazione multipla - spettrometria di massa
- Transizioni per SRM / MRM analisi possono essere selezionati e ottimizzati infondendo un 1 picomole soluzione per microlitro di peptide standard nel 30% di acido formico acetonitrile/0.1% nello spettrometro di massa a 0,5 microlitri / min. Una volta a spruzzo sia stabile, raccogliere un MS / MS dello spettro.
- Le transizioni sono selezionati dalla MS / MS dello spettro, individuando three gli ioni frammento abbondante in una regione dello spettro con poco rumore. Per moltiplicare carica ioni peptide, la y-ion frammenti rilevati a m / z> precursore m / z sono di solito i migliori per SRM / MRM sviluppo di analisi. Figura 2 mostra la MS / MS dello spettro e ioni di transizione selezionata 476,3> 508,3, 579,3 , 692,4 (transizioni per il pesante isotopo stabile non standard di 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 indicato) per il GDSLAYGLR peptide.
- A seconda della marca e del modello dello spettrometro di massa utilizzato, ci sono più parametri che possono essere ottimizzate per ogni transizione. Qui, abbiamo ottimizzato l'energia di collisione di ogni transizione selezionata dalla rampa l'energia di collisione e il monitoraggio del livello di segnale. Una energia di collisione di 25 è stato utilizzato per ogni transizione.
- In breve, una configurazione tipica per SRM / MRM analisi è la seguente: Fase mobile (A) 0,1% acido formico; (B) Acetonitrile 90% / 0,1% di acido formico, 0,3 x 5 millimetri colonna trappola C18, 75 ID micron x 15 cm C18 colonna analitica (Reprosil-Pur C18 AQ, 120 A poro °). Il volume di iniezione è 10 L e il campione viene caricato per 5 minuti a 3% B ad un flusso totale 3 ml / min ed eluita con un gradiente lineare 3-45% B a 300 - 400 Nl / min a 10 min. Condizioni su QTRAP 4000 (ABSCIEX, Foster City, CA) sono stati spruzzo 2.3kV tensione, temperatura della sorgente di ioni a 150 ° C, GS1 di 12, e di gas tenda 15.
- Il campione viene analizzato da SRM / MRM iniettando 10 ml di campione. Aree dei picchi sono integrati per peptidi leggeri e pesanti usando il programma di Skyline. 14 Calcolare il rapporto tra area del picco (PAR) del peptide senza etichetta / etichetta in ogni campione utilizzando la transizione più abbondante che è privo di rumore di fondo, in questo caso, la transizione y5 (luce peptide 476,3> 579,3, pesante standard di peptide 481,3> 589,3).
4. Rappresentante dei risultati:
Misurati i rapporti delle aree dei picchi (relativamente leggero peptide endogeno di spillo peptidi marcati con isotopi pesanti) forniscono una misura quantitativa del peptide di destinazione. Figura 3 mostra un esempio di cromatogramma peptidi leggeri e pesanti in un SISCAPA arricchito campione. Si noti che i peptidi leggeri e pesanti eluire allo stesso tempo, e le transizioni multiple possono essere monitorati per ogni peptide per confermare l'identità.
Figura 1. Una visione schematica del processo di SISCAPA. Una miscela proteica complessa viene digerito in peptidi. Analiti peptide mirati (analita endogeno e un isotopo stabile a spillo marcati con standard interno) sono arricchiti con anticorpi anti-peptide immobilizzato sulla proteina G particelle magnetiche rivestite. Dopo aver isolato, i peptidi mirate sono eluiti dalle particelle magnetiche e analizzati mediante spettrometria di massa per la quantificazione relativa allo standard interno.
Figura 2. MS / MS spettro della GDSLAYGLR peptide che mostra la selezione di tre frammenti di SRM / MRM transizioni.
Figura 3. Cromatogrammi Esempio di profilo di un picco analita peptide luce (rosso) e la pesante isotopo stabile marcati con standard interno (blu). Cromatogrammi per la transizione Y5 dal peptide luce (476,3> 579,3) e pesante isotopo stabile etichetta standard (481,3> 589,3) vengono riportati nel corso del tempo come eluire dal sistema di cromatografia.
Discussion
La fase più critica nel protocollo come descritto è garantire le perle rimangono ben mescolato durante il periodo di incubazione. Permettere le perline di depositarsi sul fondo del pozzo / flacone si tradurrà in una maggiore variabilità. E 'anche importante spin-down qualsiasi liquido che può rimanere sulla parte superiore del pozzo / flacone dopo il periodo di incubazione. Digestione tripsina riproducibile è anche critico. La procedura per la digestione qui descritto è stato utilizzato ampiamente nel nostro laboratorio in collaborazione con SISCAPA, tuttavia, è probabile che i metodi alternativi di digestione potrebbe essere ottimizzata per un dato insieme di proteine obiettivo del 15 eluizione di anticorpi liberi non interferisce con il rilevamento di. peptide, probabilmente perché l'anticorpo è esclusa dalla colonna o eluisce oltre i peptidi, ma l'anticorpo può essere reticolato di perline G della proteina prima di arricchimento affinità in esperimenti di grandi dimensioni o se anticorpi libero diventa un problema. Abbiamo anche ritenuto utile mettere un magnete sotto la piastra campione sul autocampionatore così come la colonna di lavaggio trappola in direzione inversa del flusso (rispetto al carico) per rimuovere eventuali residui di sfere o particelle. Oltre al metodo descritto perla magnetica, la tecnica può anche essere adattato a un formato di colonna (cioè cromatografia di affinità). 12, 16
Una volta che l'utente sta bene con il protocollo generale, la tecnica è anche suscettibile di varie modifiche che migliorano il test complessivo. 11 In primo luogo, è possibile analizzare analiti multipli in un singolo test combinando anticorpi nella fase di arricchimento (cioè multiplexing). Lo spettrometro di massa è in grado di analizzare simultaneamente un gran numero di analiti. In secondo luogo, aumentare il volume del campione originale migliora la sensibilità del test.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Clinica Tecnologia NSC proteomica Assessment Center (CPTAC) concedere (# U24 CA126476), così come una sovvenzione da parte dell'industria dell'intrattenimento Foundation (FEI) e la ricerca delle donne FEI Fondo cancro al Consorzio seno Discovery Cancro biomarcatori, e generosi doni dal Keck Foundation, la Fondazione Canarie, e il Paul G. Allen Family Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 | |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 | |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Foil cover for 96 well plate | Excel Scientific | 12-169 | |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| Table 1: Materials | |||
| Urea | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "no-weigh dithiothreitol" |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| Formic acid | EMD Millipore | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Table 2: Reagents | |||
| 100 mM Tris pH 8 | |||
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Stable isotope standard mastermix | |||
| Anti-peptide antibody mastermix | |||
| Table 3: Solutions to be prepared | |||
References
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