Summary
稳定同位素标准和捕捉反肽抗体（SISCAPA）夫妇亲和富集稳定同位素稀释质谱（MRM - MS）的肽作为代理人为各自的蛋白质肽的定量测量提供。在这里，我们描述了一个部分自动化的格式使用磁性粒子的协议。
Abstract
定量分析测量蛋白质有一个很大的需要。与传统的夹心免疫，主要是考虑在定量的金标准，是一个成本高，很长的时间，和充满弊端（如异嗜性抗体，抗体的干扰，“勾效应”），1另一项技术是亲和富集再加定量质谱肽，俗称为SISCAPA（稳定同位素标准和反肽抗体捕获）2。这项技术，亲和富集稳定同位素稀释和选择/多反应监测质谱检测肽（ SRM / MRM - MS）作为代理人为各自的蛋白质肽的定量测量。 SRM / MRM - MS是公认的准确定量的小分子3，4，最近已经适应在血浆和细胞裂解液中蛋白质的含量来衡量。5-7实现定量的蛋白质，这些较大的分子被消化组件肽酶如胰蛋白酶。一个或多个选定的肽，其序列是唯一的在该物种的靶蛋白（即“proteotypic”肽），然后丰富使用抗肽抗体的样品，并测量样品中的蛋白质浓度的定量计量代理人。因此，加上稳定的同位素稀释（SID）的方法（即飙升的稳定同位素标记肽标准），SRM / MRM可以用来衡量作为代理人在复杂的生物基质蛋白定量proteotypic肽的浓度。这些化验有几个优点相比传统的免疫。浓缩试剂是相对较便宜的生成，分析物的特异性良好，检测可高度复用，可以进行从整齐的等离子（没有枯竭），和该技术是适合广泛的蛋白质或修改我们在这个视频的兴趣。8-13演示了基本的协议，适应磁珠平台。
Protocol
实验过程：
该试剂盒需要合成肽和抗肽抗体。应该是唯一的选择肽感兴趣的蛋白质，含有8至22种氨基酸，并没有已知的翻译后修饰。蛋氨酸残留一般都避免和肽含有二元氨基酸（如KK，韩国KR，RR），都是不可取的。这种技术，它是共同使用内部标准的稳定同位素标记肽，结合重（13 C 和15 N）在C -末端肽（即K或R标记）标记的氨基酸。
以下协议描述来衡量鼠标蛋白骨桥蛋白肽GDSLAYGLR，使用发邮件至公司（伯林格姆，CA）和新英格兰肽（加德纳，马）的合成肽获得的抗肽抗体检测。该协议包括三个主要步骤（图1）：1）胰酶消化复杂的蛋白质混合物，2）肽的富集3）质谱分析。这将被证明添加用鼠标骨桥蛋白在人体血浆样品。
1。胰蛋白酶的酶消化和清理
- 湿冰解冻10μL整齐的血浆等份。
- 确定由BCA法测定总蛋白浓度和离心机样本，以消除任何悬浮固体。
- 吸取10μL分装，从它的存储管1000μL深孔板和皮尔斯，能够薄膜盖。
- 每个样品中加入20μL新鲜9M尿素/ 30MM二硫苏糖醇（DTT）（终浓度为6M尿素/ 20mm的数码地面电视）。
- 30分钟在37 ° C。
- 每个样品中加入3μL新鲜的500毫米碘乙酰胺（50MM最终的IAM）。
- 在室温下孵育30分钟，在黑暗中。
- 加入257μL的100毫米Tris（pH值8）（稀释尿素〜0.6M）。
- 添加10μL胰蛋白酶原液（1微克/微升; 1:50酶底物比例）。
- 孵育37℃过夜（12-16小时）。
- 加入3μL整齐的甲酸（终浓度为1％）。
- 添加稳定同位素标准（如果执行一个复用的检测，通常约10μL，含有50-100 fmol的标准同位素标记的肽是多个标准添加）。
- 绿洲盒板洗净，与500μL0.1％甲酸80％乙腈，丢弃流量通过。重复此3倍。
- 加入500μL0.1％甲酸水平衡墨盒板，并丢弃的流过。重复此的4倍。
- 消化样品装入墨盒板和调整的真空，所以流动是非常缓慢。
- 500μL0.1％甲酸水清洗，并丢弃流过。重复此3倍。
- 2 × 500μL0.1％甲酸加入到1000μL深孔板的80％乙腈洗脱肽（不要丢弃流过）。
- 冻干（或speedvac）洗脱液干燥。 （冻干是首选的方法）
- 重组干肽，加入50μL的PBS + 0.03％CHAPS。
2。肽免疫浓缩
- 将样品标准翠鸟96孔板。
- 新增1微克抗体和1.5μL蛋白- G的磁性珠每个目标（交联抗体珠之前，除了它是可选的）。确保珠以及暂停摇晃或震荡。
- 盖的板带箔。
- 孵育过夜（12-16小时），轻轻翻滚，以确保珠被暂停。
- 离心5秒32 XG板箔表面除去任何液体。
- 拆下的铝箔盖。
- 洗涤和洗脱珠可以进行手动或自动方式。此过程介绍了翠鸟平台上自动化的步骤。
- 洗磁珠200μL的PBS + 0.03％CHAPS（每洗1分钟）的2倍。
- 洗磁珠200μL1:10稀释的PBS + 0.03％CHAPS（1分钟）1次。
- 肽洗脱在25 5％醋酸+ 0.03％CHAPS UL。
- 将一块磁铁洗脱板和洗脱液转移到96孔板中，注意不要转移剩余的珠子。
- 盖密封垫盘。
- 板包含洗脱液交付的三倍quadrapole分析质谱仪。
3。多反应监测分析 - 质谱
- SRM / MRM分析的转换，可以选择和优化，通过注入0.5μL/ min的质谱仪1 picomole每微升肽标准的解决方案在30％acetonitrile/0.1％甲酸。一旦获得稳定的喷涂，收集的MS / MS谱。
- 转换选择的MS / MS谱确定THRE个人在噪音小的频谱地区丰富的碎片离子。对于乘电荷的多肽离子，检测Y -离子碎片为m / z的m / z>易制毒化学通常是最好SRM / MRM检测发展的。图2显示的MS / MS谱和选定的过渡离子476.3> 508.3 ，579.3肽GDSLAYGLR 692.4（转变为重稳定同位素标准481.3> 518.3，589.3，702.4未显示）。
- 根据制作和使用分光计的质量模型，也有多个参数，可以为每个过渡优化。在这里，我们通过提高碰撞能量和监测的信号电平优化每个选定的过渡的碰撞能量。一个25的碰撞能量被用于每个过渡。
- 简单来说，是一个典型的配置SRM / MRM分析如下：流动相（A）0.1％的甲酸;（二）90％的乙腈/ 0.1％甲酸，0.3 × 5毫米C18陷阱列，编号75微米× 15厘米C18分析柱（Reprosil - PUR C18 AQ，120 °孔）。注射量为10μL，样品装载在总流量在3％B级为5分钟，3μL/ min的线性梯度洗脱从3 - 45 300％B级 - 400 NL /分钟，10分钟内。在4000 QTRAP（ABSCIEX，福斯特城，加利福尼亚州）的条件，喷雾电压2.3kV，离子源温度150℃，12日，GS1的窗帘气15。
- 样品分析SRM / MRM注入10μL的样品。峰面积集成14计算无标签/标记在每个样本最丰富的过渡，是免费的背景噪音，在这种情况下，使用肽的峰面积比（PAR），Y5过渡使用的程序天际线的轻型和重型肽。 （光肽，重标准肽481.3> 589.3 476.3> 579.3）。
4。代表性的成果：
测得的峰面积比值（轻内源性肽相对飙升的重同位素标记的肽）提供的目标肽的定量测量。图3显示了在一个SISCAPA丰富的样品的轻型和重型肽例如色谱。请注意，轻型和重型肽洗脱同时和多个过渡可用于确认身份的每个肽监测。
图1。SISCAPA过程的示意图。是一个复杂的蛋白质混合物消化成肽。丰富蛋白质的G -磁性粒子固定化反肽抗体针对性肽分析物（内源性分析物和一个飙升的稳定同位素标记的内部标准）。以下隔离，有针对性的肽洗脱的磁性粒子和质量法相对的内部标准定量分析。
图2的MS / MS谱显示SRM / MRM转变的三个片段的肽GDSLAYGLR 。
图3。范例色谱显示轻肽待测峰形（红色）和沉重的稳定同位素标记的内部标准（蓝色） 。 Y5光肽（476.3> 579.3）和沉重的稳定同位素标记的过渡色谱标准（481.3> 589.3）随着时间的推移，他们绘制洗脱色谱系统。
Discussion
所述的协议中最关键的一步是确保珠保持在发病潜伏期间，充分混合。允许珠定居以及/瓶的底部，会导致变异增加。同样重要的是降速以及/瓶顶端的潜伏期后，可能会保留在任何液体。重复的胰蛋白酶消化也很关键。这里描述的消化过程已被广泛使用在我们的实验室与SISCAPA一起，但是，它是消化可能的替代方法，可以为一个给定的目标蛋白进行了优化的15游离抗体洗脱不干预的检测。肽，可能因为排除列或流出最迟肽抗体，但抗体可交联G蛋白珠之前，在大量的实验，或者如果游离抗体的亲和力浓缩成了一个问题。我们还发现它有用的地方一个自动进样器的样品板以及洗衣机在反向流动陷阱列下面的磁铁（加载），以除去残留的珠子或颗粒。除了 磁珠描述的方法，这项技术也可以适应一个列的格式（即亲和层析），12， 16
一旦用户的总体协议感到满意，该技术也适合进行若干修改，提高整体检测。11首先，它有可能在浓缩步骤（即复）相结合的抗体，在一个单一的检测分析多种分析。质谱仪能够同时分析大量的分析物。其次，越来越多的原始样本量，提高了检测的灵敏度。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是资助由美国国立癌症研究所临床蛋白质组学的技术评估中心（CPTAC）授予（＃U24 CA126476）以及授予的乳腺肿瘤生物标志物发现联盟的娱乐产业基金会（EIF），并在EIF的妇女的癌症研究基金，并凯克基金会，加那利基金会，和保罗G. Allen的家庭基金会的厚礼。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 | |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 | |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Foil cover for 96 well plate | Excel Scientific | 12-169 | |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| Table 1: Materials | |||
| Urea | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "no-weigh dithiothreitol" |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| Formic acid | EMD Millipore | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Table 2: Reagents | |||
| 100 mM Tris pH 8 | |||
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Stable isotope standard mastermix | |||
| Anti-peptide antibody mastermix | |||
| Table 3: Solutions to be prepared | |||
References
- Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).
- Anderson, N. L. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).
- Chace, D. H., Kalas, T. A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).
- Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).
- Barr, J. R. Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).
- Kuhn, E. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).
- Whiteaker, J. R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).
- Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).
- Kuhn, E. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
- Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).
- Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
- Ackermann, B. L., Berna, M. J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).
- MacLean, B. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Proc, J. L. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
- Berna, M. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).
