Summary
Padrões de Isótopos estáveis e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.
Abstract
Há uma grande necessidade de ensaios quantitativos para medir proteínas. Imunoensaios sanduíche tradicional, amplamente considerado o padrão ouro na quantificação, estão associados a um alto custo, longo tempo, e estão repletas de desvantagens (por exemplo, anticorpos heterofílicos, a interferência auto-anticorpos, 'gancho-efeito "). Uma técnica Uma alternativa é o enriquecimento de afinidade de peptídeos acoplado com espectrometria de massa quantitativos, comumente referido como SISCAPA (Padrões de Isótopos Estáveis e Captura de Anticorpos Anti-Peptide). 2 Nesta técnica, a afinidade de enriquecimento de peptídeos com a diluição de isótopos estáveis e detecção de selecionados / múltiplos de reação monitoramento espectrometria de massa ( SRM / MRM-MS) fornece medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. SRM / MRM-MS está bem estabelecido para a quantificação precisa de pequenas moléculas 3, 4 e mais recentemente foi adaptado para medir as concentrações de proteínas no plasma e lisados celulares. 5-7 Para alcançar quantificação de proteínas, estas moléculas maiores são digeridos para peptídeos componente usando uma enzima, como tripsina. Um ou mais peptídeos selecionados cuja seqüência é exclusivo para a proteína-alvo, em que as espécies (ou seja, "proteotypic" peptídeos) são, então, enriquecido a partir da amostra usando anticorpos anti-peptídeo e medido como substitutos estequiométrica quantitativa para a concentração de proteína na amostra. Assim, acoplado a diluição de isótopos estáveis (SID) (ou seja, um spiked-in isótopo estável rotulados peptídeo standard), SRM / MRM podem ser usados para medir as concentrações de peptídeos proteotypic como substitutos para a quantificação de proteínas em matrizes biológicas complexas. Métodos Os ensaios têm várias vantagens em comparação com imunoensaios tradicional. Os reagentes são relativamente menos caro para gerar, a especificidade para o analito é excelente, os ensaios podem ser altamente multiplexados, de enriquecimento pode ser realizado a partir do plasma puro (sem esgotamento necessário), ea técnica é passível de uma grande variedade de proteínas ou modificações de interesse. 8-13 Neste vídeo podemos demonstrar o protocolo básico, adaptado a uma plataforma magnética talão.
Protocol
Procedimento experimental:
O ensaio requer peptídeos sintéticos e anticorpos anti-peptídeo. Peptídeos selecionados deve ser exclusivo para a proteína de interesse, conter entre 8 e 22 aminoácidos, e não tem conhecido modificações pós-translacionais. Resíduos de metionina são geralmente evitada e peptídeos contendo aminoácidos dibásicos (por exemplo, KK, KR, RR) são indesejáveis. Para esta técnica, é comum o uso de peptídeos isótopo estável rotulados como normas internas, incorporando pesado (13 C e 15 N) marcado aminoácidos no C-terminal do peptídeo (ou seja, K ou R rotulados).
O protocolo a seguir descreve um teste desenvolvido para medir a GDSLAYGLR peptídeo da proteína Osteopontina mouse, utilizando anticorpos anti-peptídeo obtido a partir de Epitomics Inc. (Burlingame, CA) e peptídeos sintéticos da Nova Inglaterra Peptide (Gardner, MA). O protocolo consiste em três etapas principais (Figura 1): 1) Tripsina digestão das proteínas complexas, 2) Enriquecimento de peptídeos 3) Análise por espectrometria de massa. Será demonstrado em uma amostra de plasma humano enriquecida com a proteína Osteopontina mouse.
1. Tripsina digestão enzimática e limpeza
- Thaw 10 mL alíquota plasma puro em gelo molhado.
- Determinar a concentração de proteínas totais por ensaio BCA e centrifugar a amostra para remover quaisquer sólidos em suspensão.
- Pipeta alíquota de 10 L de seu tubo de armazenamento para uma placa Deepwell 1000 mL e cubra com pierce-able filme.
- Adicionar 20 mL de 9M fresco uréia / 30mm ditiotreitol (DTT) (final de concentração 6M TDT uréia / 20mm) para cada amostra.
- Incubar por 30 minutos a 37 ° C.
- Adicionar 3 mL de iodoacetamida mM fresco 500 (IAM final de 50 mM) para cada amostra.
- Incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente.
- Adicionar 257 mL de 100 mM Tris (pH 8) (dilui uréia para 0,6 M ~).
- Adicionar 10 mL de tripsina solução estoque (1 mg / mL; para 01:50 enzima: substrato).
- Incubar 37 ° C durante a noite (12-16 horas).
- Adicionar 3 mL de ácido fórmico pura (concentração final de 1%).
- Adicionar padrão de isótopos estáveis (padrões múltiplos são adicionados se realizar um ensaio multiplex, geralmente essa é cerca de 10 mL contendo 5-10 fmol de peptídeo isotopicamente marcado standard).
- Lavar a placa do cartucho Oasis bem com 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila 80%, descartando o escoamento. Repita 3 vezes.
- Equilibrar a placa do cartucho, adicionando 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, e descartar o escoamento. Repita isso 4 vezes.
- Carregar amostras digerir a placa do cartucho e ajustar o vácuo de modo que o fluxo é muito lento.
- Lavar com 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, e descartar por escoamento. Repita 3 vezes.
- Peptídeos eluir pela adição de 2 x 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila 80% em 1000 prato fundo bem-mL (não descartam a flow-through).
- Lyophilize (ou speedvac) o eluído até à dessecação. (Liofilização é o método preferido)
- Reconstituir secas peptídeos pela adição de 50 mL PBS + 0,03% CHAPS.
2. Peptídeo de enriquecimento de imunoafinidade
- Transferir a amostra a norma Kingfisher 96 placas bem.
- Adicionar um anticorpo mg e 1,5 mL da proteína G-esferas magnéticas revestidas por alvo (que é opcional para crosslink o anticorpo para as contas antes disso). Garantir contas são bem suspenso por agitação ou vórtex.
- Cobrir a placa com papel alumínio.
- Incubar overnight (12-16 horas) com suave caindo para garantir contas são suspensas.
- Centrífuga placa a 32 xg por 5 segundos para remover qualquer líquido a partir da superfície da folha.
- Remova a cobertura de alumínio.
- Lavagem e eluição das contas pode ser feita manualmente ou de forma automatizada. Este procedimento descreve as etapas automatizadas em uma plataforma de Kingfisher.
- Lave as contas duas vezes com 200 mL PBS + 0,03% CHAPS (1 minuto por lavagem).
- Lave as contas uma vez com 200 mL de diluição de 1:10 de PBS + CHAPS 0,03% (1 minuto).
- Os peptídeos são eluídos em 25 uL de 5% de ácido acético + CHAPS 0,03%.
- Coloque a placa de eluição em um ímã e transferir o eluato para um prato de 96 poços, tendo o cuidado de não transferir as contas sobra.
- Cobrir a placa com um tapete de vedação.
- A placa contendo o eluato é entregue ao espectrômetro de massas triplo quadrapole para análise.
3. Análise por monitoramento de reações múltiplas - espectrometria de massa
- Transições para SRM / MRM análise podem ser selecionados e otimizados pela infusão de uma solução picomole 1 por microlitro do padrão de peptídeos em 30% de ácido fórmico acetonitrile/0.1% para o espectrômetro de massa de 0,5 mL / min. Uma vez de spray estável é obtido, recolher um espectro de MS / MS.
- Transições são selecionados a partir do espectro MS / MS, identificando three íons fragmento abundantes em uma região do espectro com pouco ruído. Para multiplicar-íons carregados peptídeo, os fragmentos y-ion detectado em m / z> precursor m / z são normalmente o melhor para o SRM / MRM desenvolvimento ensaio. Figura 2 mostra o espectro de MS / MS e íons de transição selecionados 476,3> 508,3, 579,3 , 692,4 (transições para o pesado isótopo estável padrão não 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 mostrado) para a GDSLAYGLR peptídeo.
- Dependendo da marca e modelo do espectrômetro de massa utilizada, existem vários parâmetros que podem ser otimizados para cada transição. Aqui, nós otimizamos a energia de colisão de cada transição selecionados por ramping a energia da colisão e monitoramento do nível de sinal. A energia de colisão de 25 foi usado para cada transição.
- Resumidamente, uma configuração típica para SRM / MRM análise é a seguinte: Fase móvel (A) ácido fórmico 0,1%, (B) acetonitrila 90% / 0,1% de ácido fórmico, 0,3 x 5 mm coluna armadilha C18, 75 mM ID x 15 cm coluna analítica C18 (Reprosil-Pur AQ C18, 120 A poros °). O volume de injeção é de 10 mL da amostra e é carregado por 5 min a B 3% a uma vazão total de 3 mL / min e eluída por um gradiente linear 3-45% B no 300-400 nL / min em 10 min. Condições em um QTRAP 4000 (ABSCIEX, Foster City, CA) foram spray de 2,3 kV de tensão, temperatura da fonte de íons de 150 ° C, GS1 de 12, e gás de cortina 15.
- A amostra é analisada por SRM / MRM, injetando 10 mL da amostra. Áreas dos picos são integrados para peptídeos leves e pesados usando o Skyline programa. 14 Calcule a razão da área de pico (PAR) do peptídeo unlabeled / rotulados em cada amostra usando a transição mais abundante que é livre de ruído de fundo, neste caso, a transição y5 (peptídeo luz 476,3> 579,3, pesado peptídeo padrão 481,3> 589,3).
4. Resultados representativos:
Medida razões das áreas de pico (em relação peptídeo luz endógena para peptídeo pesados spiked isotopicamente marcado) fornecer uma medida quantitativa do peptídeo alvo. Figura 3 mostra um exemplo de cromatograma peptídeos leves e pesados em uma amostra SISCAPA enriquecido. Note-se que os peptídeos leves e pesados eluir no mesmo tempo e várias transições podem ser monitorados para cada peptídeo para confirmar a identidade.
Figura 1. Panorama Um esquema do processo SISCAPA. Uma mistura de proteínas complexo é digerido em peptídeos. Analitos peptídeo alvo (analito endógenos e uma spiked isótopo estável com etiqueta padrão interno) são enriquecidos com anticorpos anti-peptídeo imobilizada em proteína G-revestido partículas magnéticas. Após isolamento, os peptídeos são alvo eluída as partículas magnéticas e analisados por espectrometria de massa para quantificação em relação ao padrão interno.
Figura 2. MS / MS espectro da GDSLAYGLR peptídeo mostrando seleção de três fragmentos de SRM / MRM transições.
Figura 3. Cromatogramas Exemplo mostrando o perfil de pico de um analito peptídeo de luz (vermelho) eo pesado isótopo estável com etiqueta padrão interno (azul). Cromatogramas para a transição y5 do peptídeo luz (476,3> 579,3) e de isótopos estáveis pesados rotulados padrão (481,3> 589,3) são plotados ao longo do tempo como eles saem da sistema de cromatografia.
Discussion
O passo mais crítico no protocolo, conforme descrito é garantir as contas permanecem bem misturado durante o período de incubação. Permitindo que as contas para se depositar no fundo do poço / frasco irá resultar em aumento da variabilidade. Também é importante para spin-down qualquer líquido que possa permanecer no topo do poço / frasco após o período de incubação. Digestão com tripsina reprodutíveis também é crítica. O procedimento para a digestão descrita aqui tem sido utilizada extensivamente em nosso laboratório em conjunto com SISCAPA, no entanto, é provável que os métodos alternativos de digestão pode ser otimizado para um determinado conjunto de proteínas-alvo 15 eluição do anticorpo livre não interfere com a detecção do. peptídeo, provavelmente porque o anticorpo é excluído da coluna ou elui mais tarde do que os peptídeos, mas o anticorpo pode ser reticulado às esferas G Protein antes de afinidade em experiências de enriquecimento de grande ou se anticorpo livre se torna um problema. Temos também que era útil para colocar um ímã sob a placa de amostra no amostrador automático, bem como lavar a coluna armadilha na direção contrária do fluxo (em comparação com a carga) para remover todas as pérolas residual ou partículas. Além da abordagem magnética talão descrito, a técnica também pode ser adaptado para um formato de coluna (ou seja, cromatografia de afinidade). 12, 16
Quando o usuário está confortável com o protocolo geral, a técnica também é passível de várias modificações que melhoram o ensaio geral. 11 Primeiro, é possível analisar analitos múltiplos em um único ensaio, combinando anticorpos na etapa de enriquecimento (multiplexação por exemplo). O espectrômetro de massa é capaz de analisar simultaneamente um grande número de analitos. Segundo, aumentando o volume de amostra original melhora a sensibilidade do ensaio.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Clínica NCI Tecnologia Proteômica Assessment Center (CPTAC) conceder (# U24 CA126476), bem como uma concessão da indústria do entretenimento Foundation (FEI) eo Fundo das Mulheres FEI Pesquisa do Câncer da Mama Consórcio Descoberta Cancer Biomarker, e generosas doações da Fundação Keck, a Fundação Canárias e dos Paul G. Allen Família Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 | |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 | |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Foil cover for 96 well plate | Excel Scientific | 12-169 | |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| Table 1: Materials | |||
| Urea | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "no-weigh dithiothreitol" |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| Formic acid | EMD Millipore | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Table 2: Reagents | |||
| 100 mM Tris pH 8 | |||
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Stable isotope standard mastermix | |||
| Anti-peptide antibody mastermix | |||
| Table 3: Solutions to be prepared | |||
References
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