Summary
Stabila isotopen standarder och Capture av Anti-peptidantikroppar (SISCAPA) par affinitet anrikning av peptider med stabila isotoputspädning masspektrometri (MRM-MS) för att ge kvantitativ mätning av peptider som substitut för sina respektive proteiner. Här beskriver vi det protokoll som använder magnetiska partiklar i en delvis automatiserad format.
Abstract
Det finns ett stort behov av kvantitativa analyser för att mäta proteiner. Traditional sandwich immunologiska, till stor del anses vara den högsta standarden inom kvantifiering, är förknippade med en hög kostnad, lång ledtid, och är fylld med nackdelar (t.ex. heterofila antikroppar, autoantikroppar störningar, "hook-effekt"). 1 En alternativ teknik är affinitet anrikning av peptider tillsammans med kvantitativa masspektrometri, vanligen kallat SISCAPA (stabil isotop standarder och Capture av Anti-peptid antikroppar). 2 I denna teknik, samhörighet anrikning av peptider med stabila isotoputspädning och detektering av utvalda / flera reaktion övervakning masspektrometri ( SRM / MRM-MS) ger kvantitativ mätning av peptider som substitut för sina respektive proteiner. SRM / MRM-MS är väl etablerad för exakt kvantifiering av små molekyler 3, 4 och på senare tid har anpassats för att mäta halter av proteiner i plasma och lysates cellen. 5-7 För att uppnå kvantifiering av proteiner, dessa större molekyler ned till komponent peptider med hjälp av ett enzym som trypsin. En eller flera utvalda peptider vars sekvens är unik för målprotein för att arter (dvs "proteotypic" peptider) då berikas från provet med hjälp av anti-peptid antikroppar och mätt som kvantitativa stökiometriska surrogat för protein i provet. Därför kopplade till stabila isotopen utspädning (SID) metoder (dvs. en tillsats-i stabila isotopen märkt peptid-standard), kan SRM / MRM användas för att mäta koncentrationer av proteotypic peptider som substitut för kvantifiering av proteiner i komplexa biologiska matriser. De analyser har flera fördelar jämfört med traditionella immunanalys. Reagensen är relativt billigare att generera, är specificitet för analyten utmärkt, kan analyserna mycket att multiplex, kan anrikning utföras från snygg plasma (ingen utarmning krävs), och tekniken är mottaglig för ett brett spektrum av proteiner eller modifieringar av intresse. 8-13 I denna video visar vi de grundläggande protokoll som är anpassade till en magnetisk kula plattform.
Protocol
Tillvägagångssätt:
Analysen kräver syntetiska peptider och anti-peptid antikroppar. Valda peptider bör vara unikt för proteinet av intresse, innehålla mellan 8 och 22 aminosyror och har inga kända post-translationella modifieringar. Metionin restprodukter i allmänhet undvikas och peptider som innehåller dibasiskt aminosyror (t.ex. KK, KR, RR) är önskvärt. För denna teknik är det vanligt att använda stabila isotopen märkta peptider som interna standarder, som omfattar tunga (13 C och 15 N) märkta aminosyror vid C-terminus av peptiden (dvs K eller R-märkta).
Följande protokoll beskriver en analys utvecklades för att mäta peptid GDSLAYGLR från musprotein osteopontin med anti-peptid antikroppar från Epitomics Inc. (San Francisco) och syntetiska peptider från New England peptid (Gardner, MA). Protokollet består av tre steg (Figur 1): 1) Trypsin nedbrytning av den komplexa proteinblandningens 2) Berikning av peptider 3) Analys av masspektrometri. Det kommer att demonstreras på en människa plasmaprov spetsades med musen Osteopontin protein.
1. Trypsin enzymatisk spjälkning och sanering
- Tina 10 mikroliter snygg plasma alikvot på våt is.
- Bestäm den totala proteinkoncentration av BCA analys och centrifugera provet för att avlägsna suspenderade partiklar.
- Pipettera 10 mikroliter alikvot från dess lagring rör till en 1000 mikroliter deepwell tallrik och täck med Pierce-stånd film.
- Tillsätt 20 mikroliter av färska 9M urea / 30mm ditiotreitol (DTT) (slutlig koncentration 6M urea / 20mm DTT) till varje prov.
- Inkubera 30 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 3 mikroliter av färska 500 mm iodoacetamide (slutlig IAM 50mm) till varje prov.
- Inkubera i 30 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Tillsätt 257 mikroliter av 100 mM Tris (pH 8) (späder urea till ~ -0,6).
- Tillsätt 10 mikroliter av trypsin stamlösning (1 mikrogram / l. för 1:50 enzym: substrat ratio).
- Inkubera 37 ° C över natten (12-16 timmar).
- Tillsätt 3 mikroliter av snyggt myrsyra (slutlig koncentration av 1%).
- Lägg till stabila isotopen standard (flera standarder läggs om att utföra en multiplex analys, typiskt det här handlar om 10 mikroliter innehåller 50-100 fmol av standard isotopiskt-märkta peptid).
- Tvätta Oasis patronen plattan bra med 500 mikroliter på 0,1% myrsyra i 80% acetonitril och kassera de genomströmning. Upprepa detta 3 gånger.
- Jämvikt patronen plattan genom att tillsätta 500 mikroliter av 0,1% myrsyra i vatten och kasta genomströmning. Upprepa detta fyra gånger.
- Ladda smälta prover till patronen plattan och justera vakuum så flödet är mycket långsam.
- Tvätta med 500 mikroliter på 0,1% myrsyra i vatten och kasta genomströmning. Upprepa detta 3 gånger.
- Eluera peptider genom att lägga 2 x 500 mikroliter av 0,1% myrsyra i 80% acetonitril i 1000 l djupt brunnar (Kasta inte bort det flow-through).
- Lyophilize (eller speedvac) eluatet till torrhet. (Frystorkning är att föredra)
- Rekonstituera torkade peptider genom att lägga till 50 mikroliter PBS + 0,03% käkar.
2. Peptide immunoaffinity anrikning
- Överför provet till standard Kingfisher 96 bra plattor.
- Tillsätt 1 mikrogram antikropp och 1,5 mikroliter Protein-G belagd magnetiska kulor per mål (det är frivilligt att Crosslink antikroppen att kulorna före tillägg). Se till att pärlorna är väl avbrytas genom skakning eller vortexa.
- Täck plattan med folie.
- Inkubera över natten (12-16 timmar) med mild tumlande att se pärlor upphävas.
- Centrifugera plattan vid 32 xg under 5 sekunder för att avlägsna vätska från folien ytan.
- Ta bort folien locket.
- Tvättning och eluering av pärlor kan utföras manuellt eller i ett automatiserat sätt. Denna procedur beskriver stegen automatiserade på en Kingfisher plattform.
- Tvätta pärlor 2 gånger med 200 mikroliter PBS + 0,03% CHAPS (1 minut per tvätt).
- Tvätta pärlor en tid med 200 mikroliter 1:10 utspädning av PBS + 0,03% CHAPS (1 minut).
- Peptiderna elueras i 25 uL av 5% ättiksyra + 0,03% käkar.
- Placera eluering plattan på en magnet och överföra all vätska en 96 brunnar, se till att inte överföra överblivna pärlor.
- Täck plattan med en tätning matta.
- Plattan innehåller eluatet levereras till den tredubbla quadrapole masspektrometer för analys.
3. Analys av multipla reaktion övervakning - masspektrometri
- Övergångar för SRM / MRM analys kan väljas och optimeras genom att ingjuta en 1 picomole per mikroliter lösning av peptid standard i 30% acetonitrile/0.1% myrsyra i masspektrometer vid 0,5 ml / min. När en stabil dusch erhålls, samla in en MS / MS spektrum.
- Övergångar väljs från MS / MS spektrum genom att identifiera three rikligt fragment joner i en region av spektrumet med lite buller. För multiplicera laddade-peptid joner, y-jon-fragment upptäcktes vid m / z> föregångare m / z är vanligtvis det bästa för SRM / MRM analys utveckling. Figur 2 visar MS / MS spektrum och utvalda joner övergången 476,3> 508,3, 579,3 , 692,4 (övergångar för den tunga stabila isotopen standard 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 visas inte) för peptid GDSLAYGLR.
- Beroende på märke och modell som används masspektrometer, det finns flera parametrar som kan optimeras för varje övergång. Här optimerad vi kollisionsenergi av varje vald övergång genom ramp kollisionen energi och övervaka nivån på signalen. En kollision om 25 har använts för varje övergång.
- Kortfattat är en typisk konfiguration för SRM / MRM analysen på följande sätt: Mobil fas (A) 0,1% Myrsyra, (B) 90% Acetonitril / 0,1% myrsyra, 0,3 x 5 mm C18 fälla kolumn, 75 ìm ID x 15 cm C18 analytiska kolonnen (Reprosil-Pur C18 AQ, 120 A ° porer). Injektionen volym är 10 mikroliter och provet är laddad i 5 min vid 3% B till ett sammanlagt flöde 3 ml / min och elueras med en linjär övertoning från 3 till 45% B vid 300 till 400 NL / min i 10 min. Villkoren på en 4000 QTRAP (ABSCIEX, Foster City, CA) var dimma spänning 2.3kV, jonkälla temperatur 150 ° C, GS1 av 12 och gardin gas 15.
- Provet analyseras av SRM / MRM genom att injicera 10 mikroliter av provet. Peak områden är integrerade för lätta och tunga peptider använda programmet Skyline. 14 Beräkna toppytan ratio (PAR) i omärkta / märkta peptid i varje prov med hjälp av den mest förekommande övergången som är fri från bakgrundsljud, i detta fall y5 övergången (ljus peptid 476,3> 579,3, tunga standard peptid 481,3> 589,3).
4. Representativa resultat:
Mätt toppytan nyckeltal (ljus endogen peptid i förhållande till spetsiga tunga isotopiskt-märkta peptid) ger ett kvantitativt mått på målet peptid. Figur 3 visar ett exempel kromatogrammet för lätta och tunga peptider i ett SISCAPA berikade prov. Observera att lätta och tunga peptider eluera på samma gång och flera övergångar kan övervakas för varje peptid för att bekräfta identitet.
Figur 1. En schematisk översikt över SISCAPA processen. En komplex protein blandning rötas till peptider. Riktade peptid analyter (endogena analyt och en tillsats stabil isotop-märkta intern standard) är berikad med hjälp av anti-peptid antikroppar immobiliserade på Protein G-belagd magnetiska partiklar. Efter isolering, är de riktade peptider elueras från de magnetiska partiklarna och analyseras med masspektrometri för kvantifiering i förhållande till den interna standarden.
Figur 2. MS / MS spektrum av peptiden GDSLAYGLR visar urval av tre fragment för SRM / MRM övergångar.
Figur 3. Exempel på kromatogram som visar toppen profilen av en ljus peptid analyt (röd) och den tunga stabila isotopen-märkta interna standarden (blå). Kromatogram för y5 övergången från ljus peptid (476,3> 579,3) och tunga stabil isotop märkt standard (481,3> 589,3) plottas över tiden som strömmar de ut från kromatografi systemet.
Discussion
Det mest kritiska steget i protokollet som beskrivs är att se pärlorna är väl blandad under inkubationstiden. Att låta pärlor att bosätta sig på botten av brunnen / flaskan kommer att resultera i ökad variabilitet. Det är också viktigt att snurra ner någon vätska som kan finnas kvar på toppen av brunnen / flaska efter inkubationstiden. Reproducerbar trypsin digestion är också kritisk. Förfarandet för matsmältningen beskrivs här har använts i stor utsträckning i vårt laboratorium i samband med SISCAPA, dock är det troligt alternativa metoder för matsmältningen kan vara optimerad för en viss uppsättning målproteiner 15 eluering av fri antikropp inte stör detektion av. peptid, troligen på grund av att antikroppen är undantagna från kolumn eller eluerar senare än peptider, men antikroppen kan tvärbunden att kulorna Protein G före affinitet anrikning i stort experiment, eller om fri antikropp blir ett problem. Vi har också funnit det lämpligt att placera en magnet under provet plattan på autosampler samt tvätt fällan kolumn i motsatt riktning av flödet (jämfört med lastning) att ta bort eventuella pärlor eller partiklar. Förutom de magnetiska pärlor beskrivs förhållningssätt kan tekniken också anpassas till en kolumn format (dvs affinitetskromatografi). 12, 16
När användaren är bekväm med det övergripande protokollet, är den teknik som också kan bli föremål för flera förändringar som ökar den totala analysen. 11 För det första är det möjligt att analysera flera analyter i ett och samma analys genom att kombinera antikroppar i anrikning steget (dvs Multiplexing). En masspektrometer är samtidigt kunna analysera ett stort antal analyter. För det andra att öka volymen av ursprungliga provet ökar känsligheten i analysen.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NCI Klinisk proteomik Technology Assessment Center (CPTAC) bevilja (# U24 CA126476) samt ett stipendium från Entertainment Industry Foundation (EIF) och EIF kvinnors Cancer Research Fund till Bröstcancer biomarkörer Consortium, och generösa gåvor från Keck stiftelsen, Kanarieöarna Foundation och Paul G. Allen Family Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 | |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 | |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 97002540 | |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| Foil cover for 96 well plate | Excel Scientific | 12-169 | |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen Scientific | 521-01-151 | |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 | |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HSP 9601 | |
| Table 1: Materials | |||
| Urea | Sigma-Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce, Thermo Scientific | 20291 | "no-weigh dithiothreitol" |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega Corp. | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28300 | |
| Formic acid | EMD Millipore | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Table 2: Reagents | |||
| 100 mM Tris pH 8 | |||
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time | ||
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |||
| Stable isotope standard mastermix | |||
| Anti-peptide antibody mastermix | |||
| Table 3: Solutions to be prepared | |||
References
- Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).
- Anderson, N. L. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).
- Chace, D. H., Kalas, T. A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).
- Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).
- Barr, J. R. Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).
- Kuhn, E. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).
- Whiteaker, J. R. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).
- Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).
- Kuhn, E. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
- Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).
- Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
- Ackermann, B. L., Berna, M. J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).
- MacLean, B. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Proc, J. L. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
- Berna, M. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).
