Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Summary

Discussion

Ряд методов были использованы ранее дифференцировать эритроидных клеток в культуре с переменным успехом. Например, некоторые протоколы без со-культуры на MS-5 позволяет расширение эритроидных клеток, но не эффективным в производстве полностью зрелых безъядерных эритроцитов ^12-17. Хотя другие методы позволяют эффективно энуклеации, это за счет распространения ^18,19. Метод, который мы использовали здесь, первоначально разработанный Дуэ лаборатории ^6, сочетает в исходной жидкости шаг культуры, которая продлевает ячейки усиления на ранних стадиях дифференциации эритроидных и, следовательно, дает нам большое количество ранних предшественников (необходимых для геномики и протеомики исследований) , и второй этап совместного культуры на MS-5 мезенхимальные клетки, что очень важно, чтобы максимизировать синтеза гемоглобина и получить полную энуклеации красных кровяных телец. Два ограничения нашего метода являются: 1) по-прежнему недостаточной степени усиления на ранних стадиях дифференцировки, которая пока не позволяет нам в полной мере характеризуют очень ранних эритроидных предшественников на уровне белка и 2) высокие затраты на выполнение этого протокола, Особенно в крупных масштабах.

Качество культуре клеток и цитокинов реагентов имеет важное значение для бывших дифференциации естественных эритроидных. Следует отметить, что использование BIT (табл. 2) в качестве замены сыворотки имеет решающее значение. Действительно, в нашем опыте использования БИТ устранены от партии к партии изменения, которые мы испытывали ранее (вероятно, из-за различий в чистоте реагентов) при использовании отдельных источников Бычий сывороточный альбумин, инсулин и трансферрина. Другим важным моментом является качество MS-5 слой используется для совместного культуры эритроидных клеток. В самом деле, MS-5 клетки должны быть 70%, когда сливной эритроидных клетках добавляются и необходимо менять каждые 3-4 дней. Если MS-5 клетками слишком сливающийся, эритроидных клеток, не будет расти и дифференцироваться должным образом. Кроме того, нездоровая MS-5 клеток, как правило, отделить, делая уборку эритроидных клеток трудно.

Предыдущие методы использовали ретровирус для генной доставки в гемопоэтических стволовых / прогениторных клеток в культуре. Тем не менее, ретровирусы заражают только делящиеся клетки, и поэтому не эффективны в основном заражение покоя CD34 ⁺ клетки, выделенные из пуповинной крови, костного мозга или лейкафереза ^​​20. Главное преимущество лентивирусов подходов к генной доставки, что позволяет эффективно заражения клеток независимо от их распространения статуса ^7,21. Наши лентивирусов-опосредованной доставки генов позволяет эффективно нокдаун или по-экспресс специфические факторы транскрипции, которые могут изменить судьбу ячейки. Соответствующие фенотипический анализ (клеточных и молекулярных) может быть разработан после заражения выявить особенности фенотипов. Кроме того, рост условия могут быть изменены в пользу частности клеточных типов после заражения. По этим линиям, в этом протоколе мы решили не использовать любые методы, чтобы выбрать лентивирус-инфицированные клетки по двум основным причинам: 1) наши инфекции эффективность очень высока (рис. 6С) и 2), мы обеспокоены тем, что методы, используемые для выбора лентивирус-инфицированные клетки (например, клеточной сортировки или антибиотик) смещены в сторону выживания / пролиферирующие клетки, которые способны выражать либо антибиотикам ген устойчивости или флуоресцентного маркера на высоком уровне тем самым скрывая потенциальных апоптоза фенотипа.