Summary
و
Abstract
تكون الكريات الحمر هو نظام نموذجي تستخدم عادة لدراسة تمايز الخلايا. أثناء تكون الكريات الحمر ، والكبار الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) تفرق في oligopotent الأسلاف ، والسلائف ملتزمة وخلايا الدم الحمراء الناضجة 1. وينظم هذه العملية جزءا كبيرا على مستوى الجينات ، حيث عوامل النسخ النسب المحددة تنشيط جينات معينة في حين تقمع متزامنة الجينات التي هي محددة لأنواع الخلايا الأخرى 2. وكثيرا ما تتم الدراسات على عوامل النسخ التي تنظم تكون الكريات الحمر باستخدام خطوط الخلايا البشرية والفئران التي تمثل ، إلى حد ما ، والخلايا الحمر في مراحل معينة من التمايز 3-5. يمكن تحويل خطوط الخلية ولكن جزئيا فقط تحاكي الخلايا محمر والأهم من ذلك أنها لا تسمح لأحد لدراسة مفهومة التغيرات الدينامية التي تحدث مع تقدم الخلايا من خلال عدة مراحل من أجل مصيرهم محمر النهائي. ولذلك ، فإن التحدي الحالي لا يزال في وضع بروتوكول للحصول على السكان متجانسة نسبيا من الخلايا الأولية وHSCs محمر في مراحل مختلفة من التمايز في الكميات التي تكفي لإجراء التجارب والجينوميات البروتيوميات.
نحن هنا وصف خلية فيفو السابقين بروتوكول للحث على تمايز الثقافة محمر من الخلايا الجذعية البشرية / السلف للدم التي تم عزلها من دم الحبل السري سواء ، ونخاع العظام أو الدم المحيطي الكبار حشدت مع G - CSF (leukapheresis). ثقافة هذا النظام ، وضعت في البداية من قبل المختبر Douay 6 ، يستخدم السيتوكينات وشارك الثقافة على خلايا اللحمة المتوسطة لتقليد المكروية نخاع العظام. باستخدام هذا التمايز فيفو السابقين البروتوكول ، أن نلاحظ التضخيم قوية من أسلاف محمر ، وتحريض تمايز حصرا نحو النسب محمر والنضج الكامل إلى مرحلة منزوعة النواة خلايا الدم الحمراء. وبالتالي ، فإن هذا النظام يوفر فرصة لدراسة الآلية الجزيئية لتنظيم النسخي كما تقدم الخلايا الجذعية المكونة للدم على طول نسب محمر.
دراسة تكون الكريات الحمر على الصعيد الترانسكربتي يتطلب أيضا القدرة على عوامل محددة الإفراط في التعبير عن ضربة قاضية أو محمر في الخلايا الأولية. لهذا الغرض ، ونحن نستخدم تسليم الجين الفيروسة البطيئة بوساطة نظام يسمح لكفاءة كل من العدوى وعدم تقسيم تقسيم خلايا 7. هنا نظهر أننا قادرون على ضربة قاضية بكفاءة TAL1 عامل النسخ في الخلايا الأولية محمر الإنسان. بالإضافة إلى ذلك ، GFP التعبير يدل على كفاءة عدوى lentiviral ما يقرب من 90 ٪. وهكذا ، لدينا بروتوكول يوفر نظام مفيدا للغاية لتوصيف الشبكة التنظيمية للعوامل النسخ التي تكون الكريات الحمر السيطرة.
Discussion
وقد تم استخدام عدد من الأساليب للتمييز من قبل الخلايا الحمر في الثقافة بدرجات متفاوتة من النجاح. على سبيل المثال ، بعض البروتوكولات بدون ثقافة مشتركة على MS - 5 يتيح التوسع في الخلايا محمر ولكن ليست فعالة في انتاج ناضجة تماما منزوعة النواة خلايا الدم الحمراء 12-17. في حين أن الوسائل الأخرى تسمح استئصال كفاءة ، فهو على حساب انتشار 18،19. الطريقة التي استخدمناها هنا ، وضعت في البداية من قبل المختبر Douay 6 ، يجمع بين الثقافة خطوة أولية السائل ، الذي يطيل التضخيم الخلية أثناء المراحل الأولى من تمايز محمر ، وبالتالي يوفر لنا مع أعداد كبيرة من الأسلاف في وقت مبكر (اللازمة لدراسات الجينوم والبروتيوميات) ، والخطوة الثانية من الثقافة المشتركة على خلايا اللحمة المتوسطة MS - 5 ، وهو أمر مهم لتحقيق أقصى قدر من الهيموغلوبين التوليف ، والحصول على استئصال كامل للخلايا الدم الحمراء. قيدين من أسلوب لدينا هي 1) درجة لا تزال غير كافية من التضخيم في المراحل الأولى من تمايز ، والتي منعت حتى الآن لوصف لنا تماما في وقت مبكر جدا الأسلاف محمر على مستوى البروتين و 2) ارتفاع تكلفة تنفيذ هذا البروتوكول ، ولا سيما على نطاق واسع.
نوعية الكواشف خلية ثقافة والسيتوكينات ضروري لتمايز السابقين محمر الجسم الحي. خصوصا ، واستخدام BIT (الجدول 2) كبديل المصل أمر بالغ الأهمية. بل في تجربتنا استخدام BIT القضاء دفعة إلى دفعة الاختلافات التي مررنا بها سابقا (على الأرجح بسبب الاختلافات في نقاء كاشف) عند استخدام مصادر مستقلة من الأبقار مصل الانسولين ، والزلال ترانسفيرين. نقطة أخرى حاسمة هي نوعية طبقة MS - 5 تستخدم للثقافة المشتركة للخلايا الحمر. في الواقع ، يجب أن MS - 5 الخلايا تكون متكدسة 70 ٪ عند إضافة خلايا محمر ويجب تغيير كل 3-4 أيام. إذا MS - 5 الخلايا متموجة جدا ، وسوف لا تنمو خلايا محمر والتفريق بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، غير صحية MS - 5 خلايا تميل الى فصل ، مما يجعل الخلايا الحمر حصاد صعبة.
وقد استخدمت الأساليب السابقة الارتجاعي لتسليم الجينات في الخلايا الجذعية / السلف في الثقافة المكونة للدم. ومع ذلك ، الفيروسات القهقرية تصيب الخلايا فقط الانقسام وبالتالي فهي ليست فعالة في اصابة هادئة أساسا على الخلايا CD34 + المعزولة من دم الحبل السري ونخاع العظام أو leukapheresis 20. والميزة الرئيسية للنهج lentiviral لتسليم الجينات هو أنه يسمح للعدوى كفاءة الخلايا بشكل مستقل عن حالة انتشارها 7،21. تسليم لدينا الجينات lentiviral بوساطة يسمح احد لضربة قاضية بكفاءة أو المبالغة في التعبير عن عوامل النسخ المحددة التي يمكن تعديل مصير الخلية. ويمكن وضع التحليلات المناسبة المظهري (الخلوية والجزيئية) بعد الإصابة للكشف عن الظواهر معينة. بالإضافة ، قد غيرت شروط النمو لصالح أنواع معينة الخلية بعد الإصابة. على طول هذه الخطوط ، في هذا البروتوكول اخترنا عدم استخدام أي وسيلة لتحديد الخلايا المصابة الفيروسة البطيئة لسببين رئيسيين هما : 1) كفاءتنا العدوى عالية جدا (الشكل 6C) و 2) ونحن نشعر بالقلق من أن الأساليب المستخدمة لتحديد متحيزة الفيروسة البطيئة الخلايا المصابة (على سبيل المثال الخلية الفرز أو المضادات الحيوية) على قيد الحياة نحو / تكاثر الخلايا التي هي قادرة على التعبير عن الجينات إما المقاومة للمضادات الحيوية أو علامة الفلورسنت عند مستويات مرتفعة بذلك النمط الظاهري يخفي المحتملة أفكارك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر L. Douay ومولودية Giarratana (جامعة باريس السادسة ، فرنسا) للحصول على المشورة بشأن المفاضلة المجراة سابقا محمر ، D. ألان واتكينز H. (OHRI ، كندا) لتوفير عينات الدم (التي تم الحصول عليها تحت مستشفى أوتاوا مجلس أخلاقيات البحث # 2007804 - 01H) ، D. Trono (ايكول بوليتكنيك دي الاتحادية لوزان) لتوفير ناقلات lentiviral وFJ Dilworth (OHRI ، كندا) لقراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا المشروع من خلال منحة CIHR (MOP - 82813) لMBCGP هي المستفيدة من صندوق البحوث أونتاريو الحاسوبية زمالة التدريب Regulomics بعد الدكتوراة. MB يحمل كرسي أبحاث كندا في تنظيم التعبير الجيني.
References
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
- Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
- Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
- Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
- Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
- Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
- Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
- Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
- Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
- Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
- Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
- Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
- Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
- Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
- Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
- Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
- Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).
