Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Summary

Abstract

Erythropoiesis היא מערכת מודל נפוץ ללמוד התמיינות תאים. במהלך erythropoiesis, pluripotent אדם מבוגר hematopoietic בתאי גזע (HSCs) להתמיין אבות oligopotent, מבשרי מחויב ובוגרת כדוריות דם אדומות ^1. תהליך זה מווסת על חלק גדול ברמה של ביטוי גנים, לפיו גורמי שעתוק ספציפיים להפעיל השושלת גנים ספציפיים במקביל תוך הדחקת גנים ספציפיים סוגי תאים אחרים ^2. מחקרים על גורמי תעתוק ויסות erythropoiesis מבוצעות בדרך כלל באמצעות שורות תאים אנושיים המייצגות Murine, במידה מסוימת, תאים erythroid בשלבים נתון של בידול ^3-5. שורות תאים יכולים להפוך זאת באופן חלקי בלבד לחקות תאים erythroid והכי חשוב הם לא מאפשרים אחד comprehensibly המחקר שינויים דינמיים המתרחשים התקדמות תאים בשלבים רבים לקראת גורלו הסופי erythroid שלהם. לכן, האתגר הנוכחי נותר פיתוח פרוטוקול להשיג אוכלוסיות הומוגניות יחסית של HSCs הראשי erythroid תאים בשלבים שונים של התמיינות בכמויות מספיקות כדי לבצע גנומיקה ניסויים proteomics.

כאן אנו מתארים vivo לשעבר לתא תרבות פרוטוקול להשרות התמיינות erythroid מן האדם גזע / ובתאים hematopoietic שהיו מבודדים מהדם או טבורי, מח עצם או דם היקפי מבוגר מגויסת עם G-CSF (leukapheresis). מערכת זו תרבות, שפותחה לראשונה על ידי המעבדה Douay ^6, משתמשת ציטוקינים ושיתוף תרבות על תאים mesenchymal לחקות את microenvironment מח עצם. שימוש בפרוטוקול לשעבר בידול vivo, אנו צופים הגברה חזקה של אבות erythroid, אינדוקציה של דיפרנציאציה אך ורק כלפי השושלת erythroid ו התבגרות להשלים לשלב enucleated כדוריות דם אדומות. לכן, מערכת זו מספקת הזדמנות ללמוד את המנגנון המולקולרי של ויסות תעתיק התקדמות בתאי גזע hematopoietic לאורך השושלת erythroid.

לימוד erythropoiesis ברמה תעתיק גם דורש את היכולת גורמים ספציפיים מעל מפורשת או מציאה ב העיקרי תאים erythroid. לשם כך, אנו משתמשים lentivirus בתיווך משלוח גן מערכת המאפשרת זיהום יעיל של שניהם חלוקת ולא חלוקת תאים ^7. כאן אנו מראים כי אנו מסוגלים ביעילות מציאה גורם שעתוק בתוך TAL1 העיקרי erythroid תאים אנושיים. בנוסף, ביטוי של GFP מדגים יעילות של זיהום lentiviral קרוב ל 90%. לפיכך, פרוטוקול שלנו מספק מערכת שימושית מאוד עבור אפיון של רשת רגולטורית של גורמי תעתוק כי erythropoiesis שליטה.

Discussion

מספר שיטות שימשו בעבר להבדיל תאים erythroid בתרבות עם דרגות משתנות של הצלחה. לדוגמה, כמה פרוטוקולים ללא תרבות משותפת על MS-5 מאפשרת הרחבה של תאים erythroid אך אינם יעילים בהפקת לבגרות מלאה בתאי דם אדומים enucleated ^12-17. בעוד שיטות אחרות לאפשר enucleation יעיל, זה על חשבונם של התפשטות ^18,19. השיטה השתמשנו כאן, שפותחה לראשונה על ידי המעבדה Douay ^6, המשלבת צעד ראשון תרבות נוזלי, אשר מאריך הגברה התא במהלך השלבים המוקדמים של בידול erythroid ובכך מספק לנו מספר גדול של אבות מוקדם (הכרחי הגנומיקה ומחקרים proteomics) , ואת השלב השני של תרבות משותפת על MS-5 תאים mesenchymal, וזה חשוב על מנת למקסם את סינתזת המוגלובין להשיג enucleation מלאה של כדוריות דם אדומות. שתי מגבלות השיטה שלנו הם 1) את מידת מספיק עדיין הגברה בשלבים המוקדמים של בידול, שעד כה מנעה מאיתנו מלא לאפיין את אבות מוקדם מאוד erythroid ברמת חלבון 2) את העלות הגבוהה של ביצוע הפרוטוקול, במיוחד בקנה מידה גדול.

איכות תרבות ריאגנטים התא ציטוקינים חיונית ההבחנה לשעבר erythroid vivo. יש לציין כי השימוש BIT (טבלה 2) כתחליף בסרום היא קריטית. ואכן בחוויה שלנו את השימוש BIT בוטלו אצווה ל-אצווה וריאציות שחווינו בעבר (סביר בשל ההבדלים טוהר מגיב) כאשר באמצעות מקורות נפרדים של שור אינסולין בדם, אלבומין ו transferrin. עוד נקודה קריטית היא איכות שכבת MS-5 המשמש תרבות משותפת של תאים erythroid. ואכן, MS-5 תאים יש ומחוברות 70% כאשר תאים erythroid מתווספים יש לשנות את כל 3-4 ימים. אם MS-5 תאים ומחוברות יותר מדי, התאים erythroid לא יגדל להבחין כראוי. בנוסף, לא בריא MS-5 תאים נוטים לנתק, מה שהופך את קצירת התאים erythroid קשה.

שיטות הקודם השתמשו רטרווירוס למסירה, גנים גזע / ובתאים hematopoietic בתרבות. עם זאת, רטרווירוסים להדביק רק תאים מתחלקים ולכן אינם יעילים הדבקה של שקט בעיקר CD34 ⁺ תאים מבודדים דם טבורי, מח עצם או leukapheresis ^20. היתרון העיקרי של גישות lentiviral עבור משלוח של גן הוא שהיא מאפשרת זיהום יעילה של תאים באופן עצמאי מעמד התרבות שלהם ^7,21. משלוח lentiviral בתיווך שלנו הגן מאפשר מציאה ביעילות או יתר להביע גורמי שעתוק ספציפיים שיכולים לשנות את גורל התא. מנתח פנוטיפי המתאים (תאית ומולקולרית) יכול להיות המציאו לאחר ההדבקה לחשוף פנוטיפים בפרט. בנוסף, תנאי הגידול עשויים להשתנות לטובת מסוים התא סוגי לאחר ההדבקה. ברוח דברים אלה, בפרוטוקול זה בחרנו לא להשתמש בכל שיטה כדי לבחור lentivirus תאים הנגועים משתי סיבות עיקריות: 1) יעילות ההדבקה שלנו הוא גבוה מאוד (איור 6C) ו 2) אנו חוששים כי האמצעים שננקטו כדי לבחור lentivirus תאים הנגועים (למשל תאים מיון או אנטיביוטיקה) מוטים כלפי לשרוד / מתרבים התאים מסוגלים לבטא את הגן או עמידות לאנטיביוטיקה או את הסמן פלורסנט ברמות גבוהות ובכך מסתיר פנוטיפ אפופטוטיים פוטנציאליים.