レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で赤血球

Summary

アン

Abstract

赤血球は細胞の分化を研究するために一般的に使用されるモデルシステムです。赤血球中に、多能性成体ヒト造血幹細胞（HSC）はoligopotent前駆細胞、コミットされた前駆体および成熟赤血球¹に分化する。このプロセスは、付随して他の細胞タイプ²に固有の遺伝子を抑制する一方、特定の転写因子は、系統特異的遺伝子を活性化により、遺伝子発現のレベルでの大部分は規制されています。赤血球産生を制御する転写因子に関する研究は多くの場合、赤血球細胞が分化^3-5の特定の段階で、ある程度、表現するヒトおよびマウス細胞株を使用して実行されます。しかし、形質転換細胞株は、部分的にしか赤血球系細胞を模倣することができますし、最も重要な、彼らは1つが理解しやすく、最終的な赤血球の運命に向かって多くの段階を経て細胞の進捗状況として発生する動的な変化を研究することはできません。したがって、現在の課題は、ゲノミクスおよびプロテオミクスの実験を行うのに十分な量で分化の様々な段階での主造血幹細胞と赤血球細胞の比較的均質な集団を得るために、プロトコルの開発のまま。

ここでは、臍帯血、骨髄、またはG - CSF（白血球搬出）を動員成人末梢血のいずれかから単離されたヒト造血幹/前駆細胞から赤血球分化を誘導するためにex vivoでの細胞培養のプロトコルについて説明します。最初にDouay研究所⁶によって開発されたこの培養系は、、骨髄の微小環境を模倣する間葉系細胞にサイトカインと共培養を使用しています。このex vivoの分化のプロトコルを使用して、我々は、赤血球前駆細胞の強力な増幅、排他的に赤血球系統と除核赤血球のステージへの完全な成熟に向かって分化誘導を観察。したがって、このシステムは、赤血球の系統に沿って造血幹細胞の進行など、転写制御の分子機構を研究する機会を提供しています。

転写レベルでの赤血球産生を研究することも主要な赤血球系細胞で過剰発現やノックダウン、特定の要因に能力を必要とします。この目的のために、我々は⁷分割し、非分裂細胞の両方を効率的に感染を可能にするレンチウイルスを介した遺伝子送達系を使用してください。ここで我々は効率的に初代ヒト赤血球系細胞における転写因子のTAL1をノックダウンすることができることを示している。さらに、GFPの発現は90％近くにレンチウイルス感染効率を示しています。従って、我々のプロトコルは、制御赤血球その転写因子の調節ネットワークの特性評価のための非常に有用なシステムを提供します。

Discussion

メソッドの数は、成功の可変度と文化の中で赤血球系細胞を区別するために以前に使用されている。例えば、MS - 5上で共培養することなく一部のプロトコルは、赤血球系細胞の拡張を使用できますが^{、12月17日} 、完全に成熟した除核赤血球の生産に効率的ではありません。他の方法が効率的に眼球摘出を可能にする一方で、それが増殖^18,19を犠牲にしています。我々が最初にDouay研究室⁶で開発された、ここで使用されている方法は、（ゲノミクスおよびプロテオミクス研究のために必要な）赤血球分化の初期段階で細胞の増幅を長引かせるため、早期の前駆細胞の多数を提供してくれる最初の液体培養工程を、組み合わせたもの、およびヘモグロビンの合成を最大化すると赤血球の完全摘出を取得することが重要であるMS - 5間葉系細胞、上の共培養の第二段階。私たちのメソッドの2つの制限は、これまで完全に蛋白質のレベルと、このプロトコルを実行する2）高コストで、非常に初期の赤血球前駆細胞を特徴づけるために私たちを妨げている分化の初期段階での増幅の1）はまだ不十分な程度であり、特に大規模で。

細胞培養の試薬 ​​やサイトカインの質は、 生体外で赤血球分化に必須である。特に、血清代替物としてのBITの使用（表2）は重要です。確かに我々の経験でBITの使用は、ウシ血清アルブミン、インスリンとトランスフェリンの異なるソースを使用するときに我々が（おそらく試薬の純度の違いに起因する）以前に経験したバッチ間のばらつきを排除。もう一つの重要な点は、赤血球系細胞の共培養に用いるMS - 5層の品質です。赤血球細胞が追加されると3〜4日ごとに変更する必要があるとき確かに、MS - 5細胞は70％コンフルエントにする必要があります。 MS - 5細胞があまりにも密である場合、赤血球細胞は成長し、適切に区別しません。さらに、不健康なMS - 5細胞は、赤血球系細胞の収穫が困難になる、デタッチする傾向がある。

従来の方法は、培養中の造血幹細胞/前駆細胞の遺伝子配信のためにレトロウイルスを使用している。しかし、レトロウイルスは分裂細胞に感染し、臍帯血、骨髄や白血球搬出^部20から分離された主に静止CD34 ⁺細胞^を感染のため、効率的ではありません。遺伝子送達のためのレンチウイルスのアプローチの主な利点は、それが独立してその増殖状態^7,21の細胞の効率的な感染をできることです。私たちのレンチウイルスを介した遺伝子デリバリーは、細胞の運命を変更することができる効率的にノックダウンまたは過剰発現する特異的な転写因子への1つできます。適切な表現型の解析（細胞や分子）が特定の表現型を明らかにするために感染した後に考案することができる。さらに、成長条件は、感染後、特定の細胞タイプを優先するように変更される可能性があります。これらの線に沿って、このプロトコルでは我々は2つ​​の主な理由レンチウイルス感染細胞を選択する任意のメソッドを使用しないことを選択した：1）私達の感染効率が非常に高くなります（図6C）、2）我々は方法が選択するために使用されることを懸念しているレンチウイルス感染細胞（例えば、セルの並べ替えや抗生物質）のどちらか、それによって潜在的なアポトーシス表現型を隠す高レベルで抗生物質耐性遺伝子や蛍光マーカーを発現することができる細胞を生存/増殖に偏っています。