Summary
Een
Abstract
Erytropoëse is een veel gebruikte modelsysteem om celdifferentiatie te bestuderen. Tijdens de erytropoëse, pluripotente volwassen humane hematopoietische stamcellen (HSC) differentiëren in oligopotent voorvaderen, betrokken precursoren en rijpe rode bloedcellen 1. Dit proces wordt geregeld voor een groot deel op het niveau van genexpressie, waarbij specifieke transcriptiefactoren te activeren lijn-specifieke genen, terwijl gelijktijdig het onderdrukken van genen die specifiek zijn voor andere soorten cellen 2. Studies over transcriptiefactoren reguleren erytropoëse worden vaak uitgevoerd met behulp van mensen en muizen cellijnen die, vertegenwoordigen tot op zekere hoogte, erythroïde cellen bij gegeven stadia van differentiatie 3-5. Maar getransformeerde cellijnen kan slechts gedeeltelijk nabootsen erythroïde cellen en het belangrijkste is dat het niet mogelijk om een begrijpelijk studie van de dynamische veranderingen die de vooruitgang als cellen ontstaan door vele podia naar hun uiteindelijke erythroid lot. Daarom is een actuele uitdaging blijft de ontwikkeling van een protocol bij relatief homogene bevolking van de primaire HSC en erythroïde cellen te verkrijgen in verschillende stadia van differentiatie in hoeveelheden die voldoende zijn om genomics en proteomics experimenten uit te voeren.
Hier beschrijven we een ex vivo celkweek-protocol om erythroïde differentiatie te induceren van humane hematopoietische stam / voorlopercellen die zijn geïsoleerd van beide navelstrengbloed, beenmerg, perifeer bloed of volwassen gemobiliseerd met G-CSF (leukaferese). Deze cultuur-systeem, in eerste instantie ontwikkeld door de Douay laboratorium 6, maakt gebruik van cytokines en co-cultuur op mesenchymale cellen na te bootsen het beenmerg micro-omgeving. Met behulp van deze ex vivo differentiatie protocol, zien we een sterke versterking van erytroïde voorouders, een inductie van differentiatie enkel ten aanzien van de erytroïde lijn en een volledige rijping van het stadium van enucleated rode bloedcellen. Zo, dit systeem biedt de mogelijkheid om het moleculaire mechanisme van transcriptionele regulatie als hematopoietische stamcellen vooruitgang langs de erytroïde lijn te bestuderen.
Studeren erytropoëse op het transcriptionele niveau vereist ook de mogelijkheid om over-express of knockdown specifieke factoren in primaire erythroid cellen. Hiervoor maken we gebruik van een lentivirus-gemedieerde gen-levering systeem dat zorgt voor de efficiënte infectie van zowel delende als niet-delende cellen 7. Hier laten we zien dat we in staat zijn om efficiënt te knockdown de transcriptiefactor TAL1 in primaire menselijke erythroid cellen. Daarnaast, GFP expressie toont een rendement van lentivirale infectie bijna 90%. Zo, onze-protocol zorgt voor een zeer nuttig systeem voor de karakterisering van de regulerende netwerk van transcriptiefactoren die controle erythropoiese.
Discussion
Een aantal methoden zijn eerder gebruikt om de cellen te differentiëren erythroïde in cultuur met een variabele mate van succes. Bijvoorbeeld, sommige protocollen zonder co-cultuur op de MS-5 maakt uitbreiding van erythroïde cellen, maar zijn niet efficiënt in het produceren van volledig rijpe enucleated rode bloedcellen 12-17. Terwijl andere methoden is het mogelijk een efficiënte enucleatie, is het ten koste van de proliferatie 18,19. De methode die we hier hebben gebruikt, in eerste instantie ontwikkeld door de Douay laboratorium 6, combineert een eerste vloeistof cultuur stap, welke cel versterking verlengt tijdens de vroege stadia van erytroïde differentiatie en daarmee voorziet ons van een groot aantal van vroege voorouders (nodig voor genomics en proteomics studies) , en een tweede stap van co-cultuur op MS-5 mesenchymale cellen, wat belangrijk is voor hemoglobine synthese te maximaliseren en om volledige enucleatie van rode bloedcellen te verkrijgen. Twee beperkingen van onze methode zijn 1) de nog steeds ontoereikende mate van versterking in de vroegste stadia van differentiatie, die tot nu toe heeft ons ervan weerhield om volledig aan de zeer vroege erytroïde voorlopercellen karakteriseren op eiwit niveau en 2) de hoge kosten van het uitvoeren van dit protocol, met name op een grote schaal.
De kwaliteit van de celkweek reagentia en cytokines is essentieel voor de ex vivo erythroid differentiatie. Met name het gebruik van BIT (tabel 2) als een serum vervanger is van cruciaal belang. Inderdaad in onze ervaring van het gebruik van BIT geëlimineerd batch-to-batch variaties die we ervaren eerder (waarschijnlijk te wijten aan verschillen in de reagens zuiverheid) bij het gebruik van afzonderlijke bronnen van Bovine serumalbumine, Insuline en transferrine. Een ander kritisch punt is de kwaliteit van de MS-5 laag die voor co-cultuur van erythroid cellen. Inderdaad, moet MS-5-cellen worden 70% confluent wanneer erythroïde cellen worden toegevoegd en moet worden vervangen om de 3-4 dagen. Als MS-5-cellen zijn te confluent, zal erythroïde cellen niet groeien en differentiëren naar behoren. Daarnaast, ongezonde MS-5-cellen hebben de neiging om los, waardoor de oogsten van erythroïde cellen moeilijk.
Vorige methoden hebben gebruikt retrovirus voor gen-levering in hematopoietische stamcellen / stamcellen in cultuur. Echter, retrovirussen infecteren alleen delende cellen en zijn daarom niet efficiënt in het infecteren van de voornamelijk slapende CD34 + cellen geïsoleerd uit navelstrengbloed, beenmerg of leukaferese 20. Het belangrijkste voordeel van lentivirale benaderingen voor gen-levering is dat het een efficiënte infectie van cellen onafhankelijk van hun proliferatie status van 7,21 mogelijk. Onze lentiviraal-gemedieerde gentherapie maakt het mogelijk om efficiënt te knockdown of over-express specifieke transcriptiefactoren die lot van de cel kunnen wijzigen. Juiste fenotypische analyses (cellulair en moleculair) kan worden bedacht na infectie met bepaalde fenotypen te onthullen. Bovendien kunnen de groei voorwaarden worden aangepast om bepaalde cel-types gunst na infectie. Langs deze lijnen, in dit protocol hebben we ervoor gekozen om geen methode te gebruiken om lentivirus-geïnfecteerde cellen te selecteren om twee belangrijke redenen: 1) onze infectie-efficiëntie is zeer hoog (figuur 6C) en 2) we zijn bezorgd dat de methoden die worden gebruikt om te selecteren lentivirus-geïnfecteerde cellen (bijvoorbeeld cel-sorteren of antibiotica) eenzijdig zijn gericht op overleven / prolifererende cellen die in staat zijn om hetzij uitdrukkelijk de antibiotica-resistentie-gen of de fluorescente marker op een hoog niveau waardoor verbergt een potentiële apoptotische fenotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken L. Douay en MC Giarratana (Universite Paris VI, Frankrijk) voor advies over de ex vivo erytroïde differentiatie, D. Allan en H. Atkins (Ohří, Canada) voor het leveren van bloedmonsters (verkregen in het kader van de Ottawa Hospital Research Ethics board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) voor het verstrekken van de lentivirale vectoren en FJ Dilworth (Ohří, Canada) voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit project werd gefinancierd door een subsidie CIHR (MOP-82813) om MBCGP is een ontvanger van een Ontario Research Fund Computational Regulomics Training Postdoctoraal Fellowship. MB houdt de Canada Research Chair in de regulatie van genexpressie.
References
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
- Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
- Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
- Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
- Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
- Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
- Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
- Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
- Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
- Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
- Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
- Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
- Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
- Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
- Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
- Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
- Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).
