Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo di cellule staminali emopoietiche

Summary

Un

Abstract

Eritropoiesi è un sistema modello comunemente utilizzato per studiare la differenziazione cellulare. Durante l'eritropoiesi, pluripotenti adulte cellule staminali emopoietiche (CSE) si differenziano in cellule progenitrici oligopotent, precursori e globuli rossi maturi ^1. Questo processo è regolato in gran parte a livello dell'espressione genica, in cui fattori di trascrizione specifici attivare lineage-specifici geni, mentre in concomitanza reprimendo i geni che sono specifici per altri tipi di cellule ^2. Gli studi sui fattori di trascrizione che regolano l'eritropoiesi sono spesso eseguite utilizzando linee cellulari umane e murine che rappresentano, in qualche misura, le cellule eritroidi in fasi dato di differenziazione ^3-5. Tuttavia le linee di cellule trasformate solo in parte imitare le cellule eritroidi e, soprattutto, non consentono di studiare comprensibile i cambiamenti dinamici che si verificano come un progresso cellule attraverso molte fasi verso il loro destino finale eritroide. Quindi, una sfida attuale rimane lo sviluppo di un protocollo per ottenere popolazioni di cellule staminali relativamente omogenea primarie e cellule eritroidi a vari stadi di differenziazione in quantità sufficienti per eseguire esperimenti di genomica e proteomica.

Qui si descrive un ex vivo di cellule protocollo cultura di indurre differenziamento eritroide umane ematopoietiche da cellule staminali / progenitrici che sono state isolate dal sangue del cordone ombelicale sia, midollo osseo, o adulto sangue periferico mobilizzate con G-CSF (leucaferesi). Questo sistema di coltura, inizialmente sviluppato dal laboratorio Douay ^6, utilizza citochine e co-coltura delle cellule mesenchimali per imitare il microambiente del midollo osseo. Usando questo protocollo differenziazione ex vivo, si osserva un forte amplificazione dei progenitori eritroidi, l'induzione della differenziazione esclusivamente verso il lignaggio eritroide e una completa maturazione allo stadio di enucleato globuli rossi. Così, questo sistema offre l'opportunità di studiare il meccanismo molecolare di regolazione trascrizionale come progresso cellule staminali ematopoietiche lungo la linea eritroide.

Studiare l'eritropoiesi a livello trascrizionale richiede anche la capacità di fattori specifici sovra-espresso o atterramento in cellule primarie eritroidi. A questo scopo, usiamo un lentivirus-mediata sistema di consegna gene che permette l'infezione sia efficiente divisione e non divisione delle cellule ^7. Qui mostriamo che siamo in grado di atterramento in modo efficiente il TAL1 fattore di trascrizione in cellule primarie umane eritroidi. Inoltre, l'espressione della GFP dimostra un'efficienza di infezione lentivirali vicino al 90%. Così, il nostro protocollo prevede un sistema molto utile per la caratterizzazione della rete di regolamentazione dei fattori di trascrizione che l'eritropoiesi controllo.

Discussion

Un certo numero di metodi sono stati utilizzati in precedenza per differenziare le cellule eritroidi in coltura con gradi variabili di successo. Per esempio, alcuni protocolli senza co-coltura su MS-5 consente l'espansione delle cellule eritroidi, ma non sono efficienti nella produzione di celle enucleato completamente maturo rosso sangue ^12-17. Mentre gli altri metodi permettono l'enucleazione efficiente, è a scapito della proliferazione ^18,19. Il metodo che abbiamo utilizzato qui, inizialmente sviluppato dal laboratorio Douay ^6, combina un primo passo coltura liquida, che prolunga l'amplificazione delle cellule durante le prime fasi del differenziamento eritroide e quindi ci fornisce un gran numero di cellule progenitrici precoce (necessarie per la genomica e proteomica studi) , e una seconda fase di co-coltura su MS-5 cellule mesenchimali, che è importante per massimizzare la sintesi di emoglobina e di ottenere l'enucleazione completa dei globuli rossi. Due limiti del nostro metodo sono 1) il grado ancora insufficiente di amplificazione nelle prime fasi di differenziazione, che finora ci ha impedito di caratterizzare completamente i progenitori eritroidi molto presto a livello della proteina e 2) l'alto costo di esecuzione di questo protocollo, in particolare su larga scala.

La qualità dei reagenti di colture cellulari e delle citochine è essenziale per la differenziazione eritroide ex vivo. In particolare, l'uso della BIT (Tabella 2) in sostituzione del siero è un fattore critico. Infatti nella nostra esperienza l'uso di BIT eliminato da lotto a lotto variazioni che abbiamo sperimentato in precedenza (probabilmente a causa delle differenze nella purezza dei reagenti) quando si utilizzano fonti separate di albumina sierica bovina, insulina e transferrina. Un altro punto critico è la qualità del MS-5 strati utilizzato per co-coltura di cellule eritroidi. Infatti, MS-5 cellule devono essere il 70% confluenti quando le cellule eritroidi sono aggiunti e deve essere cambiato ogni 3-4 giorni. Se MS-5 cellule sono troppo confluenti, le cellule eritroidi non crescere e differenziare in modo corretto. Inoltre, malsano MS-5 cellule tendono a staccarsi, rendendo la raccolta di cellule eritroidi difficile.

Metodi precedenti hanno usato retrovirus per gene-consegna in ematopoietiche staminali / progenitrici delle cellule in coltura. Tuttavia, i retrovirus infettano solo cellule in divisione e quindi non sono efficienti nel infettare il riposo soprattutto cellule CD34 ⁺ isolate da sangue del cordone ombelicale, midollo osseo o leucaferesi ^20. Il principale vantaggio di approcci lentivirali per la gene-delivery è che permette una infezione efficiente delle cellule indipendentemente dal loro status proliferazione ^7,21. Il nostro lentivirale-mediata consegna del gene permette di efficienza knockdown o sovra-esprimere specifici fattori di trascrizione che possono modificare il destino della cellula. Adeguate analisi fenotipica (cellulare e molecolare) può essere messo a punto dopo l'infezione di rivelare particolari fenotipi. Inoltre, le condizioni di crescita possono essere modificate per favorire particolari tipi di cellule dopo l'infezione. Lungo queste linee, in questo protocollo abbiamo scelto di non utilizzare alcun metodo per selezionare lentivirus le cellule infettate per due motivi principali: 1) la nostra efficienza infezione è molto alto (Figura 6C) e 2) siamo preoccupati che i metodi utilizzati per selezionare lentivirus cellule infettate (ad esempio cellulari ordinamento o antibiotico) sono sbilanciata verso sopravvissuti / proliferazione delle cellule che sono in grado di esprimere il gene di resistenza agli antibiotici o il marcatore fluorescente ad alti livelli quindi nascondono un fenotipo potenziale apoptotico.