慢病毒介导的击倒在体外红细胞

Summary

一个

Abstract

红细胞是一种常用的模型系统研究细胞分化。在红细胞生成过程中，分化成多能干成人人体造血干细胞（HSCs）oligopotent的祖细胞，致力于前体^和成熟红细胞1。这个过程的调节，而随之而来的基因的表达，使特定的转录因子激活系特异性基因水平在很大程度上抑制基因的特定其他类型的^细胞 2 。调节红细胞生成的转录因素的研究往往是使用人类和小鼠细胞系的代表，在一定程度上，在红系^细胞分化3-5阶段进行。但是转化的细胞株只能部分模拟红系细胞和最重要的是，他们不会允许一个comprehensibly研究细胞的进展发生动态变化，通过对他们的最终红命运的许多阶段。因此，目前的挑战仍然是发展的一个协议，获得在不同分化阶段的数量足以执行基因组学和蛋白质组学实验小学的造血干细胞和红系细胞的相对同质的人群。

在这里，我们描述了红细胞分化诱导或者脐血，骨髓或成人外周血动员与G - CSF（leukapheresis）已经从孤立的从人体的造血干/祖细胞的体外细胞培养协议。这种文化系统，最初由Douay实验室^6，使用间质细胞的细胞因子和共培养模拟骨髓微环境。使用这种体外分化协议，我们观察到强烈的红系祖细胞，分化，专门对诱导红系和一个完整的成熟的去核的红血细胞的阶段放大。因此，这个系统提供了一个机会，研究沿红系造血干细胞的进展转录调控的分子机制。

在转录水平的研究红细胞还需要在主要的红系细胞的过度表达或敲除特定因素的能力。为此，我们使用了慢病毒介导的基因传递系统，可以高效感染分裂和非分裂细胞^7。在这里，我们表明，我们能够有效地击倒在基层的人类红系细胞的转录因子TAL1。此外，GFP的表达体现效率接近90％的慢病毒感染。因此，我们的协议提供了一个非常有用的系统控制红细胞生成的转录因子的调控网络的特征。

Discussion

许多方法已被用于以前红系细胞分化在文化与不同程度的成功。例如，没有共同培养在MS - 5某些协议允许扩大红系细胞，但不是在完全成熟的去^核红细胞12-17高效。而其他方法允许高效率的眼球摘除，这是在^牺牲扩散18,19。我们在这里使用，最初由Douay实验室⁶开发的方法，结合初始液体培养步骤，在红细胞分化的早期阶段，从而延长细胞扩增，从而为我们提供了大量早期祖细胞（基因组学和蛋白质组学研究的必要）和合作，文化上的MS - 5间质细胞，这一点很重要，以最大限度地提高血红蛋白的合成，并获得完整的红血细胞眼球摘除第二步。我们的方法的局限性：1）放大的程度仍然不足，在分化的早期阶段，迄今已阻止我们充分体现在非常早期的红系祖细胞的蛋白水平和2）执行本议定书的成本高，特别是在大规模。

体内红细胞分化的细胞培养试剂和细胞因子的质量至关重要。值得注意的是，使用的位（见表2）作为血清替代，是至关重要的。事实上，在我们的经验，使用的比特消除批次批次的变化，我们以前经历（可能是由于试剂纯度的差异），当使用单独的牛血清白蛋白，胰岛素和转来源。另一个关键的一点是红系细胞的共培养使用的MS - 5层的质量。事实上，MS - 5细胞70％融合时，红系细胞的增加和必须改变每隔3-4天。如果MS - 5细胞过于融合，红系细胞生长和分化正确。此外，不健康的MS - 5细胞的分离，使红系细胞的收获困难。

逆转录病毒基因在造血干/祖细胞培养交付使用以前的方法。然而，逆转录病毒只感染分裂细胞，因此感染主要是静态的CD34 ⁺细胞从脐带血，骨髓或leukapheresis ²⁰的效率不高。慢病毒基因传递方法的主要优点是，它允许其增殖^状态 7,21独立的细胞高效感染。我们的慢病毒介导的基因传递，可以有效地击倒或过度表达特定的转录因子，可以修改细胞的命运。感染后揭示特定的表型可以设计适当的表型分析（细胞和分子）。此外，经济增长状况可能会改变，有利于感染后特定的细胞类型。沿着这些思路，在这个协议中，我们选择了不使用任何方法选择慢病毒感染的细胞主要有两个原因：1）我们的感染效率非常高（图6C）和2）我们关注，使用的方法选择慢病毒感染的细胞（如细胞分选或抗生素）偏重生存/增殖的细胞，能够表达的抗生素抗性基因或在高水平，从而隐瞒一个潜在的细胞凋亡表型荧光标记。