Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo des cellules souches hématopoïétiques humaines

Summary

Une

Abstract

L'érythropoïèse est un système modèle couramment utilisé pour étudier la différenciation cellulaire. Pendant l'érythropoïèse, pluripotentes humain adulte des cellules souches hématopoïétiques (CSH) se différencient en progéniteurs oligopotent, précurseurs engagés et des globules rouges matures ^1. Ce processus est régi en grande partie au niveau de l'expression des gènes, par lequel les facteurs de transcription spécifiques d'activer des gènes spécifiques de lignée tout en réprimant de façon concomitante des gènes qui sont spécifiques à d'autres types cellulaires ^2. Les études sur les facteurs de transcription réglementant l'érythropoïèse sont souvent réalisées en utilisant des lignées cellulaires humaines et murines qui représentent, dans une certaine mesure, les cellules érythroïdes à des stades donnés de différenciation ^3-5. Cependant lignées cellulaires transformées ne peut que partiellement imitent les cellules érythroïdes et surtout ils ne permettent pas d'étudier les changements de manière compréhensible dynamiques qui se produisent que les progrès des cellules par de nombreuses étapes vers leur destin final érythroïdes. Par conséquent, un défi actuel reste le développement d'un protocole d'obtenir une population relativement homogène de CSH primaires et les cellules érythroïdes à différents stades de la différenciation dans des quantités qui sont suffisantes pour effectuer la génomique et la protéomique expériences.

Nous décrivons ici un protocole ex vivo de cellules de culture pour induire la différenciation érythroïde des humains hématopoïétiques cellules souches / progénitrices qui ont été isolées du sang de cordon soit, la moelle osseuse ou du sang périphérique adulte mobilisé par G-CSF (cytaphérèses). Ce système de culture, initialement développé par le laboratoire Douay ^6, utilise les cytokines et de co-culture de cellules mésenchymateuses d'imiter le microenvironnement médullaire. En utilisant ce protocole ex vivo la différenciation, on observe une forte amplification des progéniteurs érythroïdes, une induction de la différenciation exclusivement vers la lignée érythroïde et une maturation complète du stade de globules rouges énucléés. Ainsi, ce système fournit une occasion d'étudier le mécanisme moléculaire de régulation transcriptionnelle de cellules souches progresser sur la lignée érythroïde hématopoïétiques.

Etudier l'érythropoïèse au niveau transcriptionnel nécessite également la capacité de sur-exprimer ou knockdown facteurs spécifiques dans les cellules érythroïdes primaires. Pour ce faire, nous utilisons un système de lentivirus médiation du gène qui permet la livraison de l'infection efficace de diviser et de deux cellules ne se divisant ^7. Ici, nous montrons que nous sommes en mesure de l'efficacité knockdown TAL1 facteur de transcription dans les cellules érythroïdes primaires humains. En outre, l'expression de la GFP démontre une efficacité d'infection lentiviraux près de 90%. Ainsi, notre protocole fournit un système très utile pour la caractérisation du réseau de régulation des facteurs de transcription de contrôle qui l'érythropoïèse.

Discussion

Un certain nombre de méthodes ont été utilisées précédemment pour différencier les cellules érythroïdes en culture avec des degrés variables de succès. Par exemple, certains protocoles sans co-culture sur MS-5 permet l'expansion des cellules érythroïdes, mais ne sont pas efficaces dans la production à pleine maturité globules rouges énucléés ^12-17. Alors que d'autres méthodes permettant l'énucléation efficace, il est à la charge de la prolifération ^18,19. La méthode que nous avons utilisée ici, initialement développé par le laboratoire Douay ^6, combine une étape de culture liquide initial, ce qui prolonge d'amplification cellulaire pendant les stades précoces de la différenciation érythroïde et donc nous fournit un grand nombre de progéniteurs précoces (nécessaire pour la génomique et la protéomique des études) , et une seconde étape de co-culture sur MS-5 cellules mésenchymateuses, ce qui est important pour optimiser la synthèse de l'hémoglobine et d'obtenir une énucléation complète des globules rouges. Deux limites de notre méthode sont 1) le degré d'amplification encore insuffisante aux premiers stades de différenciation, qui jusqu'ici nous a empêché de bien caractériser les progéniteurs érythroïdes très tôt au niveau des protéines et 2) le coût élevé de l'exécution de ce protocole, en particulier sur une grande échelle.

La qualité des réactifs de culture cellulaire et les cytokines est essentiel pour érythroïdes ex vivo la différenciation. Notamment, l'utilisation de BITS (tableau 2) en remplacement du sérum est critique. En effet, dans notre expérience de l'utilisation du TBI éliminé par lot à lot variations que nous avons connu précédemment (probablement dues à des différences dans la pureté réactif) lors de l'utilisation des sources distinctes d'albumine sérique bovine, l'insuline et la transferrine. Un autre point critique est la qualité de la couche de MS-5 utilisé pour la co-culture de cellules érythroïdes. En effet, MS-5 cellules doivent être confluentes à 70% lorsque les cellules érythroïdes sont ajoutés et doit être changé tous les 3-4 jours. Si MS-5 cellules sont trop confluentes, les cellules érythroïdes ne grandira pas et de se différencier correctement. En outre, insalubres MS-5 cellules ont tendance à se détacher, ce qui rend la récolte des cellules érythroïdes difficile.

Les méthodes précédentes ont utilisé un rétrovirus pour le gène-livraison dans hématopoïétiques souches / progénitrices de cellules en culture. Toutefois, les rétrovirus infectent uniquement les cellules se diviser et ne sont donc pas efficaces en infectant les cellules CD34 ⁺ quiescents essentiellement isolées du sang de cordon, de moelle osseuse ou leucophérèse ^20. Le principal avantage des approches lentiviraux pour le gène de livraison est qu'il permet une infection efficace des cellules, indépendamment de leur statut de prolifération ^7,21. Notre livraison de gènes lentiviraux médiation permet de manière efficace knockdown ou sur-expriment des facteurs de transcription spécifiques qui peuvent modifier le destin des cellules. Appropriées analyses phénotypiques (cellulaire et moléculaire) peut être conçu après l'infection de révéler phénotypes particuliers. En outre, les conditions de croissance peuvent être modifiés pour une faveur particulière types de cellules après l'infection. Le long de ces lignes, dans ce protocole, nous avons choisi de ne pas utiliser n'importe quelle méthode pour sélectionner les cellules infectées par des lentivirus pour deux raisons principales: 1) notre efficacité d'infection est très élevé (figure 6C) et 2), nous craignons que les méthodes utilisées pour sélectionner lentivirus des cellules infectées (par exemple, tri cellulaire ou un antibiotique) sont biaisées en faveur survivants / prolifération des cellules qui sont capables d'exprimer le gène soit de résistance aux antibiotiques ou le marqueur fluorescent à des niveaux élevés de ce fait dissimuler un phénotype apoptotique potentiels.