Summary
使用定量PCR技术，我们展示了如何建立鸡胚CAM模型可用于定量分析的人类肿瘤细胞转移到远处器官。
Abstract
在转移的癌细胞从原发肿瘤的传播，侵入到周围组织，并扩散到远处器官。转移是一个复杂的过程，可能涉及到许多的组织类型，变量跨度的时间段，经常发生深刻的内部器官，使其难以进行调查和量化。此外，转移过程中的疗效的影响使其难以评估单一的肿瘤细胞行为方面的贡献，在转移级联的多个步骤。因此，经常进行转移检测在实验动物提供了一定的现实背景下，在其中学习转移。不幸的是，这些模型进一步复杂，其复杂的生理。鸡胚是一个独特的体内模型，克服了很多的局限性研究转移，由于绒毛尿囊膜（CAM），一个良好的血管多余的胚胎组织位于下面的蛋壳，是接受了肿瘤细胞的xenografting无障碍（图1）。此外，由于鸡胚是自然免疫缺陷，CAM容易支持正常和肿瘤组织植入。最重要的是，禽流感的CAM成功地支持大多数癌症细胞的特点，包括生长，侵袭，血管生成，和微环境重塑。这使得模型特别有用的调查导致癌转移的途径，并预测转移性癌的新的潜在疗法的反应。物种的具体铝PCR检测细胞播散，使人们有可能定量评估，是殖民统治只有25细胞的转移器官。使用人类的表皮细胞株（HEp3），我们使用这个模型来分析癌细胞的自发转移到远处器官，包括鸡胚肝脏和肺。此外，我们使用ALU - PCR协议表明，作为一种工具来分析和定量转移的单个元素的血管内，逮捕，外渗，和殖民的灵敏度和可重复性的检测。
Protocol
1。准备xenografting鸡蛋（自发转移）
- 刚下岗的受精鸡蛋孵化在一个旋转的孵化器，在100 ° F和60％的湿度为10天。鸡蛋旋转四次，每一个小时。
- 发育10天的鸡蛋都放在一个鸡蛋机架就在自己身边。一个鹅颈灯或其他合适的光源是用蜡烛鸡蛋的蛋壳射入airsac是位于蛋的钝端的光。
- 位于绒毛尿囊静脉和标记。此静脉是位于顶部的蛋壳是几个大血管交界。在此分支点血管下降，离从CAM和重视的胚胎。一个1cm见方框用铅笔在蛋壳上绘制约1厘米远离静脉分支点。包括广场周围的区域，然后用棉签在碘浸泡清洗。
- 使用一个碳化硅研磨石（DREMEL部分＃84922）是通过蛋的钝端钻一个洞到空气囊装有一个旋转刀具（DREMEL）。使用同样的工具，钻了一个洞以前绘制的正方形内的鸡蛋的顶部，阻止蛋壳膜。一个与上年底的罚款钻的25号注射器针头是用来做了一个小洞，在蛋壳膜，小心不要撕破底层的CAM。 CAM是后来脱离蛋壳膜平方米面积的使用温和的吸力创建具有自动吸液管对孔放置在airsac ¼英寸聚乙烯管件与安装的援助。申请吸后，气囊应该象征方孔下方的CAM已成功删除从蛋壳。凸轮下降后，在气囊和位于广场附近的绒毛尿囊静脉孔孔是密封的一块磁带的实验室磁带。卵随后放置在100 ° F和60％的湿度预期嫁接的肿瘤细胞，成一个固定的孵化器。顺序描述见图1。
2。准备用于静脉注射的鸡蛋（实验转移）
- 刚下岗的受精鸡蛋孵化12天，在100 ° F和60％的湿度在一个旋转的孵化器。鸡蛋旋转四次，每一个小时。
- 发育天12的鸡蛋都放在一个鸡蛋机架就在自己身边。一个鹅颈灯或其他合适的光源是用蜡烛鸡蛋的蛋壳射入airsac是位于蛋的钝端的光。
- 位于绒毛尿囊静脉和标记。 1厘米是一个0.5厘米的矩形绘制蛋壳直接静脉以上的铅笔。包括广场周围的区域，然后用棉签在碘浸泡清洗。
- 创建一个小窗口，在使用Dremmel钻头（＃118）在绘制的位置蛋壳。在删除该窗口，露出底层的蛋壳膜，随后呈现透明的矿物油下降。见一个图形的描绘图5A。
- 此时空气囊和位于广场附近的绒毛尿囊静脉孔孔是密封的一块磁带的实验室磁带。卵随后放置在100 ° F和湿度60％，预计在注射肿瘤细胞成一个固定的孵化器。
3。准备嫁接或注射的肿瘤细胞。
- xenografting，肿瘤细胞脱离他们的培养皿中，用胰蛋白酶/ EDTA，洗净，10卷的磷酸盐缓冲液（PBS），以除去残留的媒体，胰蛋白酶，或EDTA。
- 静脉注射，分离培养的细胞用非酶细胞分离解决方案，并与无血清DMEM洗。和）
- 细胞计数与hemacytometer为10-40万细胞/ ml的PBS重悬嫁接，或者在无血清DMEM悬浮在1万个细胞/毫升静脉注射。
4。接枝的新暴露的CAM（自发转移）肿瘤细胞
- 鸡蛋是从孵化器中删除和以前绘制的广场，在那里已形成新的空气袋的位置切一个小窗口。这是最容易与配备一个切割轮（＃409圆切割轮的Dremel工具）旋转工具。尖嘴钳对用于去除蛋壳的一小部分，揭露底层凸轮。
- 使用棉签（费舍尔品牌＃23-400-001）凸轮磨损的5倍。对棉花，一点血应该是明显。立即损害的CAM后，细胞悬液25μl放置到受损区域。最佳的细胞数量是确定发送mpirically但可以范围从0.5X10 5到1x10 6。鸡蛋中的窗口，是用胶带封紧，小鸡离开站立10-15分钟，为了让定居的细胞。鸡蛋15分钟后返回到静止的孵化器。
- 肿瘤是可以成长为5-8天，具体应用和性质的肿瘤细胞用线不同而有差异。顺序描述见图1。
5。静脉注射肿瘤细胞（实验转移）
- 使用30号胰岛素注射器100μL细胞悬液注入到每个胚胎的尿囊静脉，鸡蛋被退回到一个固定的孵化器，仍然有一个额外的1-7天。
- 在不同的时间点，肺或较低的CAM是从每个胚胎收获和处理的肿瘤细胞的检测，如下所述。
6。收获肿瘤和雏鸡组织
- 准备一个夹层面积。该试剂盒检测通过使用一个高度敏感的PCR方法定量分析人类的DNA转移细胞。因此，这是非常重要的，以防止外源DNA的污染。在一个专门的区域，并进行解剖，整个解剖的工具清洗在每个动物之间。为了防止您的样品交叉污染，整个解剖过程中的3套独立的工具是：一切蛋，删除除去内脏器官的原发灶和一组一组的。此外，四个洗容器用于连续冲洗每个动物之间的工具。在这些清洗顺序是：1）双蒸水，2）双蒸水，3）含氯漂白剂，以及4）70％的乙醇。
- 鸡蛋是从固定的孵化器，并置于冰上15分钟，麻醉和安乐死的动物。窗户打开，这样的肿瘤变得可见。打开窗户删除一些蛋壳更大可能是必要的的。从CAM切除原发肿瘤，称重，组织学处理。
- 从小鸡的蛋壳，切成相等的半壳径向。倒出从胚胎切割外壳，并转移到一个干净的权衡船一侧乳房上来。动物解剖用新鲜，清洁工具。动物是通过胸骨切割开。一旦胚胎是开放的，一个肝片，从左边或右边的叶收集。轻轻拉动连接到肫食道和切割采钰，连接机关内部器官随后被删除。为了收集肺切肋骨打开乳房板分离和心脏被删除。在这一点上，可能减少对肺周围的四个边（最接近头顶部沿左肋，附近的隔膜和沿气管右侧底部的左边）。为了一致性，相同的肺是收集在每个动物。采伐的组织样本保存在-20 ° C，以备以后使用，可以立即处理DNA提取。
7。基因组DNA提取和定量PCR分析
- 基因组DNA提取使用SYBR GREEN提取物 - N放大器组织PCR试剂盒（Sigma - Aldrich公司目录＃XNATRG）的组织。提取的DNA可以被转移到一个干净的Eppendorf管中，并储存在-20 ° C，或立即使用。重要的是要在核酸自由水稀释前，在随后的PCR反应中使用的DNA 1:50。另外，DNA可以提取使用任何标准DNA提取协议（泽吉尔斯达等 ，2002）。
- 人类DNA检测小鸡采用定量PCR技术对人类铝序列的具体组织。定量PCR使用ALU -特异性引物，从Exract N -放大器套件使用SYBR GREEN放大。 PCR试剂盒配备了一个2倍的反应，含有SYBR GREEN，缓冲区，盐dNTPS，Taq DNA聚合酶和Jumpstart的Taq酶抗体混合。反应混合物在终体积为15μl，引物各0.4μM。然而，对于大多数情况下，使用提取的DNA稀释1:50将提供定量数据，模板DNA的最佳数量可能需要优化经验。鸡GAPDH的引物用于PCR是在下列条件下运行，用于ALU序列作为内部控制：聚合酶激活在95 ° C为2分30个循环，在95 ° C为30秒，63 ° C第30 72 °秒，持续30℃鸡GAPDH的反应条件是相同的，用于ALU中所描述的，但是可能有必要延长40个循环的PCR。
- 转移定量分析比较实验组，对照组（Schmittgen和Livak，2008;使用ΔΔCT方法执行。泽吉尔斯达等 ，2002）。或者使用人类肿瘤细胞提取使用提取N -放大器套件（泽吉尔斯达等 ，2002）的系列稀释，可以生成标准曲线。统计的意义在于评估使用学生t检验或方差分析，对照组和实验组。
8。代表性的成果：
图1。鸡胚转移模型。 A）四个面板图说明了该模型的的关键步骤，在横截面的外观： 1。经过10天的潜伏期。 CAM已达到接近最大尺寸。对鸡蛋的顶部位置的尿囊静脉动脉和静脉明显可见。 2。后立即鸡蛋在蛋壳上钻两个孔：到airsac和一个相邻的尿囊静脉的附着点。 3。后一种轻微的真空外观已用于疏散airsac和下降的CAM。肿瘤细胞（蓝色）适用于下降的CAM。 4。使嫁接的肿瘤细胞生长后，连同从鸡胚胎组织肿瘤的收获进行分析B）模型的序列描述： 1。孵蛋，2。这标志着尿囊静脉的位置，3。在蛋壳上钻洞，4。滴药凸轮，5。切割肿瘤嫁接细胞，6开幕。将肿瘤细胞，7。在冰上冷却鸡蛋事先收集组织，8。收获后肿瘤生长7天。
图2。CAM的肿瘤组织学。从荷瘤绒毛尿囊膜组织被固定在福尔马林，切片，与三色染色处理。一）HEp3肿瘤后7天在CAM的增长。 B和C显示放大显示肿瘤和基质地区。 D）法线的CAM。
图3。纵向分析定量转移 。高或低的转移能力（HEp3 M（高）和HEp3 M（低）分别）的头部和颈部癌HEp3的变种进行了分析，他们有能力传播使用铝PCR。十大动物进行了分析，在每个时间点为7天的时间。对这些样本进行了量化的标准曲线，并随后表示＃cells/50mg组织。
图4。在动物体内自发转移细胞的抑制与转移抑制抗体1A5的治疗。使用5X10 5到10天的胚胎CAM应用的HEp3细胞形成肿瘤。申请一半的动物治疗的肿瘤细胞与抗CD151抗体1A5后三天。从荷瘤动物的肺，两天后收获和实时定量ALU PCR扩增。相反实时定量PCR的chGAPDH被用来确认相当于宿主基因组DNA的数量（ΔΔCT方法被用于定量比较两组（二）存在。
图5。在转移性级联评估逮捕，生长和血管内 。从根本上说，转移到次要器官的定义是由三个方面的贡献：逮捕，生长速度，血管内率。这些可以量化的实验转移（A）和自发转移（二）结合使用。使用实验转移（a）逮捕定义为细胞数量检测注射后2小时。被捕细胞的生存和发展确定为细胞数量的变化24小时后注射。被定义为在天3-7扩散率增长。血管内确定使用（B）在intravasated细胞的数量是7天的转移负担，目前，超过该值由目前的第6天的转移性负担的增长预测中定义的自发转移。
图6。 CAM中的可视化扩张的转移 。 HEp3细胞表达GFP发育12天的静脉注射。在第1天，3和5，一个鸡蛋被牺牲的CAM部分是用荧光体视显微镜成像。创建的深绿色背景是由蛋壳，血管可见的黑线，和肿瘤细胞可见的明亮的绿色斑点。
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Discussion
鸡胚CAM已使用了几十年，作为一个模型系统，研究各方面的癌症生物学和转移性进展。原则上转移能力的评估已经在这个模型中进行的各种团体，包括休眠分析（阿吉雷Ghiso等，1999; Ossowski和帝国，1983年），组织重塑 （Deryugina等，2005; 。哈恩Dantona 等 ，1999），和转移（泽吉尔斯达等 ，2008;泽吉尔斯达等 ，2002）。它仍然是一个非常有吸引力的癌症生物学的，因为其易用性，它能够接受移植瘤模型，和其成本低（钱伯斯等人，1982年，钱伯斯等，1990） 。。使用人类特定的基于ALU -定量PCR（Kim等，1998;。 泽吉尔斯达等，2002），我们表现出的能力，分析转移性传播人类cpidermoid细胞株HEp3（图3 ）。此外使用转移抑制抗体1A5（图4，（特斯塔等 ，1999年。泽吉尔斯达等 ，2008）。）我们展示了这项技术的效用在抑制治疗的评价。
除了 能够评估转移能力和治疗反应，这种模式也可以用于定量研究的转移级联（泽吉尔斯达等 ，2002）的各个组件。使用静脉注射肿瘤细胞转移的实验，这种模式允许分析癌症细胞在二级机关逮捕，并随后将其增长（图5a）。这样的增长速度，可以被用来预测在一个纵向自发转移实验的转移负担（图5b）。血管内确定使用自发转移（B）在intravasated细胞的数量是转移性负担目前7天减6天的转移性负担目前的增长预测值由定义。
随着技术的延伸报道，在这里，我们最近开发的新的战略，以可视化肿瘤细胞在体内的行为（泽吉尔斯达等2008年），它使用荧光标记的纳米粒子的目标肿瘤微环境 （丰隆等，2010; Lewis等人 ，2006年）。通过这些推进的方法，这一模式的效用可以利用可视化的复杂和动态变化，支持的生存，建立和肿瘤细胞的生长。这些技术，再加上成本相对较低，免疫缺陷性，易用性和鸡胚CAM的适应性，使这种模式成像和定量分析癌转移的宝贵。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要认识到泰森食品公司慷慨地提供受精卵。莎娜阿诺德在本议定书的拍摄。帕尔默Trenis露丝属Kirschstein国家研究服务奖（F31的美国国家癌症研究所）是由美国国立卫生研究院的支持下。部分支持这项工作是由CCSRI格兰特＃700537 JDL和NIH / NCI授予＃CA120711 - 01A1和CA120711 - 01A1对AZ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
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