Summary
定量的PCRを用いて、我々は十分に確立されたニワトリCAMモデルは定量的に遠隔臓器へのヒト腫瘍細胞の転移を分析するために使用できる方法を示します。
Abstract
転移癌細胞が原発腫瘍から発信時には、周囲の組織に侵入し、遠隔臓器に転移する。転移は、多くの組織の種類、スパン可変の期間を含む、しばしばそれが困難な調査と定量化すること、臓器の深部に発生する可能性がある複雑なプロセスです。さらに、転移プロセスの有効性は、それが困難な腫瘍細胞の挙動の一つの側面の寄与を評価すること転移カスケードに複数のステップに影響されます。結果として、転移アッセイは頻繁に転移を研究するために、必ずしも現実的なコンテキストを提供するために、実験動物で行われます。残念ながら、これらのモデルは、彼らの複雑な生理機能によってさらに複雑です。ニワトリ胚の漿尿膜（CAM）、腫瘍細胞のxenograftingに受け入れている卵の殻の下にある血管に富んだ超胚組織のアクセシビリティのために、転移を研究するために多くの制限を克服する生体モデル内で一意です。 （図1）。また、ニワトリ胚は自然に免疫不全であるため、CAMは簡単に正常細胞と腫瘍の両方の組織の生着をサポートしています。最も重要なことは、鳥類のCAMは、正常に増殖、浸潤、血管新生、および微小環境の改造を含め、ほとんどのがん細胞の特性をサポートしています。これは、癌の転移につながると新たな潜在的な治療への転移性癌の応答を予測するために経路の調査のためのモデルは非常に便利です。種特異的アルバリPCRによる播種細胞の検出は、定量的に25セルのように少数で保菌している臓器に転移を評価することが可能になります。ヒト類表皮癌細胞株（HEp3）を使用して我々は、ニワトリの肝臓、肺など遠くの臓器にがん細胞の自然転移を分析するためにこのモデルを使用してください。また、ALU - PCRのプロトコルを使用して我々は、転移の個々の要素として管内、逮捕、血管外漏出、および植民地化を分析し、定量するためのツールとして、アッセイの感度と再現性を示しています。
Protocol
1。 xenograftingために卵を準備する（自然転移）
- たての敷設受精鶏卵は100 ° F、60％の湿度で10日間回転インキュベーター中でインキュベートする。卵を4回、各時間を回転している。
- 発達10日目に卵は卵のラックに彼らの側に配置されます。ガチョウの首のランプまたは他の適切な光源がairsacが配置されている卵の鈍端に卵の殻の中に光を照らすことによってキャンドル卵をするために使用されます。
- 漿尿静脈が位置し、マークされます。この静脈は、それはいくつかの大きな血管の接合である卵殻の最上部に位置しています。この分岐点で血管がCAMから離れて、低下し、胚に取り付けます。 1センチメートル四角いボックスは、静脈の分岐点から約1cm離れて卵の殻に鉛筆で描かれています。と広場の周りを含むエリアは、ヨウ素に浸した綿棒を使用して洗浄される。
- シリコンカーバイド砥石（ドレメルの一部＃84922）穴を装備した回転切削工具（ドレメル）を使用することは気嚢に卵の鈍端貫通されています。この同じツールを使用して穴が卵殻膜の短い停止、卵の上に以前に描かれた正方形の中に掘削されている。最後に微細ないが、25ゲージの注射針は、基礎となるCAMを引き裂くように注意して卵殻膜に小さな穴を作るために使用されます。 CAMは、その後airsacの穴に対して置か¼"タイゴンチューブの部分を装着した自動ピペットエイドで作成された穏やかな吸引を用いて正方形の面積の卵殻膜から切り離される。吸引を適用する際に、エアポケットは、角の穴の下にCAMが正常に卵殻から削除されていることを示す必要があります。 CAMが削除された後は、気嚢と漿尿静脈に近い広場に位置する穴の穴は、テープの実験室でのテープの切れ端で封止されている。卵は、その後、腫瘍細胞を移植するのを見越して100 ° F、60％の湿度で静止インキュベーター内に配置されています。シーケンシャル描写するための図1を参照してください。
2。静脈内注射（実験的転移）のために卵の準備
- たての敷設受精鶏卵は100 ° F、60％の湿度で12日間の回転インキュベーター中でインキュベートする。卵を4回、各時間を回転している。
- 発達の日の12卵は卵のラックに彼らの側に配置されます。ガチョウの首のランプまたは他の適切な光源がairsacが配置されている卵の鈍端に卵の殻の中に光を照らすことによってキャンドル卵をするために使用されます。
- 漿尿静脈が位置し、マークされます。 0.5センチメートルの長方形で1センチメートルが直接静脈上記の卵の殻に鉛筆で描かれています。と広場の周りを含むエリアは、ヨウ素に浸した綿棒を使用して洗浄される。
- 小さなウィンドウがDremmelのドリルビット（＃118）を使用して描画場所で卵の殻に作成されます。ウィンドウは、その後、ミネラルオイルの低下と透明度でレンダリングされる、基になる卵殻膜を露出するために削除されます。グラフィカル用図5aを参照してください。
- この時点で、気嚢と漿尿静脈に近い広場に位置する穴の穴は、テープの実験室でのテープの切れ端で封止されている。卵は、その後、腫瘍細胞を注入するのを見越して100 ° F、60％の湿度で静止インキュベーター内に配置されています。
3。移植または注入のために腫瘍細胞を準備する。
- xenograftingの場合は、腫瘍細胞は、トリプシン/ EDTAを使用して培養皿からから切り離されているとリン酸の10倍量で洗浄し、残ったメディア、トリプシン、またはEDTAを除去するために緩衝食塩水（PBS）。
- IV注射の場合は、培養細胞は非酵素的細胞解離液を用いて分離される、および無血清DMEMで洗浄した。と）
- 細胞は血球計でカウントし、移植のために10から40000000細胞/ mlでPBSに再懸濁し、あるいは静脈注射の場合は1万細胞/ mlになるように無血清DMEMに再懸濁する。
4。新たに露出したCAM（自然転移）に腫瘍細胞を移植
- 卵はインキュベーターから削除され、小さなウィンドウが新しい空気のポケットが形成され、以前に描かれた四角の場所にカットされます。これは最も簡単にカッティングホイール（＃409円形の切断ホイールでドレメルツール）を装備した回転工具を使って行われます。ニードルノーズピンセットは、卵殻の小さなセクションを除去し、配下のCAMを公開するために使用されます。
- 綿棒を（フィッシャーブランド＃23-400-001）を使用してCAMは、5回を摩耗されています。少し血は綿に明らかであろう。すぐにCAMを損傷した後、細胞懸濁液の25μlのは、損傷した領域に配置されます。細胞の最適な数が決定される電子です。mpiricallyが0.5 × 10 5〜1 × 10 6の範囲で指定できます。卵の窓をテープでしっかりと密封され、雛は細胞が沈殿することを可能にするために10〜15分放置されています。 15分後に卵が静止インキュベーターに戻されます。
- 腫瘍は、特定のアプリケーションと使用する腫瘍細胞株の性質に応じて5-8日のために拡張されます。シーケンシャル描写するための図1を参照してください。
5。腫瘍細胞の静脈内注射（実験的転移）
- 細胞懸濁液の30ゲージのインスリンシリンジ100μLの使用は、各胚の尿膜静脈に注入され、卵が静止インキュベーターに戻し、追加の1-7日のためにそこに残った。
- 異なる時点で、肺または下CAMは、それぞれの胚から採取されると下記のように、腫瘍細胞の検出のために処理した。
6。収穫腫瘍とひよこの組織
- 解剖領域が用意されています。アッセイは高感度PCR法を用いてヒトのDNAを定量することにより転移性細胞を検出します。それは、外来DNAの混入を防止することが非常に重要です。解剖は、専用エリアで行われ、解剖を通してのツールは、それぞれの動物の間にクリーンアップされます。解剖の過程で、サンプルのクロスコンタミネーションを防止するために、ツールの3つの別個のセットが使用されています：卵を切断するための一組、一次腫瘍を除去するための一組と内臓を除去するための一組を。また、4つの洗浄容器は、各動物betweenツールのすすぎシーケンシャルに使用されます。シーケンスにこれらの洗浄は次のとおりである：1）蒸留水、2）蒸留水、3）塩素系漂白剤、及び4）70％エタノール。
- 卵は、静止インキュベーターから除去し、動物を麻酔し、安楽死させる15分間氷上に配置されます。ウィンドウは、腫瘍が見えてくるように開かれます。卵殻の一部を除去することにより大きなウィンドウを開くと、必要な場合があります。原発性腫瘍は、CAMから切除秤量し、組織学のために処理されます。
- ひよこは等しい半分に放射状に殻をカットすることで卵殻から削除されます。胚は、カットのシェルからデカントし、クリーンアップ重量ボートの胸の側に転送されます。動物は、ツールの新鮮な、きれいなセットを使用して切開されています。動物は、胸骨を切開によって開かれます。胚が開いたら、右または左葉から肝の部分が収集されます。内部器官はその後砂嚢に接続されている食道を軽く引っ張り、臓器を接続viseraを切断して除去される。肺がカット収集するためには胸郭は胸のプレートが分離されていると心が削除される開かれます。この時点では、肺の四辺の周囲にカットすることが可能です（ヘッドに最も近い上部胸郭、気管に沿って横隔膜と右側の近く下部に沿って左側）。一貫性を保つため、同じ肺は各動物で収集されます。収穫された組織サンプルは、後で使用するために-20℃で保存されている、またはDNAの分離のためにすぐに処理することができます。
7。ゲノムDNAの分離および定量的PCR解析
- ゲノムDNAは、SYBRグリーンエキス- N - Ampの組織PCRキット（Sigma - Aldrich社カタログ＃XNATRG）を使用して、組織から抽出されます。抽出されたDNAは、きれいなエッペンドルフチューブに移し、-20℃で保存するか、すぐに使用することができます。その後のPCR反応で使用する前にヌクレアーゼフリー水でDNAを1:50に希釈することが重要です。また、DNAは標準的なDNA抽出プロトコール（ザイルストラら 、2002）の任意の数を使用して抽出することができます。
- 人間のDNAをヒトのALUシーケンスのための定量的PCRの特定を使用して、ニワトリ組織で検出される。 ALU -特異的プライマーを用いた定量的PCRをExract - N - AmpのキットからSYBRグリーン増幅を使用して実行されます。 PCRキットは、SYBRグリーン、バッファー、塩のdNTPs、TaqポリメラーゼおよびJumpStart Taq抗体を含む2倍の反応ミックスが付属しています。反応ミックスは、各プライマーの0.4μMで、15μlの最終容量で構成されています。 1:50に希釈抽出したDNAを使用するほとんどのインスタンスは、定量的なデータを提供するために、しかし、テンプレートDNAの最適量は経験的に最適化する必要があります。ニワトリGAPDHのプライマーは、PCRがALUの配列について以下の条件の下で実行される内部コントロールとして使用されています：95℃ポリメラーゼの活性化95℃30サイクルで2分間のC℃で30秒、63℃の30秒30秒のため、72 ° CチキンGAPDHの反応条件は、ALUのために説明したものと同一であるしかしそれは、40サイクルのPCRを拡張する必要があるかもしれません。
- 転移の定量分析は、（SchmittgenとLivak、2008対照群と実験群を比較するΔΔCT法を使用して実行されます。ザイルストラら 、2。002）。あるいは、標準曲線は、エキス- N -アンプキット（ザイルストラら 、2002）を用いて抽出されたヒト腫瘍細胞の希釈系列を使用して生成することができます。統計学的有意差はStudentのt検定または対照群と実験群の分散分析を用いて評価されます。
8。代表的な結果：
図1。ニワトリ胚転移モデル。重要なステップの断面のモデルの外観を示すA）4つのパネルの図：1。インキュベーションの10日後。 CAMは、ほぼ最大サイズに達しました。動脈と静脈は、卵の上にリフト尿膜静脈とはっきりと表示されます。 2。すぐに卵の殻に2つの穴を掘削後の卵：airsacに1つ、尿膜静脈の接続点に隣接する1。 3。軽度の真空後の外観は、airsacを避難し、CAMを削除するために使用されています。腫瘍細胞（青）がドロップされたCAMに適用されます。 4。接木腫瘍細胞が成長させた後、ニワトリ胚からの組織とともに腫瘍を分析用に採取されるB）モデルのシリアル描写：1。卵をインキュベートする。2。尿膜静脈の位置をマーキング。、3。卵殻に穴をあける。4。 CAMを削除。、5。移植腫瘍細胞。、6の開口部を切断。腫瘍細胞を適用する。、7。組織を収集する前に氷の上に卵を冷却する。、8。成長の7日後に腫瘍を収穫。
図2。CAMの腫瘍の組織学。担癌漿尿膜から採取した組織はホルマリン、切片で固定し、トリクローム染色で処理した。 CAM上の成長の7日後A）HEp3腫瘍。 BとCが示す腫瘍と間質の両方から拡大された領域を示しています。 D）法線CAM。
図3。転移の定量的な縦分析 。ハイまたはロー転移能（HEp3 M（高）と、それぞれHEp3 M（低））と頭頸部癌HEp3のためのバリアントはアルミPCRを使用して発信する能力について分析した。 10匹は7日間の期間中、各時点で分析した。これらのサンプルは標準曲線に対して定量化し、続いて＃組織をcells/50mgとして表した。
図4。転移を阻害する抗体1A5で処理した動物の自然転移細胞の抑制 。腫瘍は日- 10胚のCAMに適用される5 × 5 HEp3細胞を用いて形成した。 half動物は抗CD151抗体1A5で処理した腫瘍細胞を適用した3日後。腫瘍を有する動物からの肺は、二日後に採取し、定量的リアルタイムALU PCRを行った。逆にchGAPDHの定量的リアルタイムPCRは、宿主のゲノムDNA（ΔΔCT法を定量的に二つのグループ（B）を比較するために使用されたのと同等の量の存在を確認するために使用されていました。
図5。転移カスケードで逮捕、成長、および脈管内への評価 。逮捕、成長率、および管内の速度：基本的に、二次臓器への転移は、三つの側面の貢献によって定義されます。これらは、実験的転移（）と自然転移（B）の組み合わせを用いて定量することができます。実験的転移（）セルの数が2時間後の注射を検出したとして逮捕が定義されているを使用する。逮捕された細胞の生存と成長は、細胞数24注射後の変化として決定されます。成長は日3月7日の間に増殖の速度として定義されています。管内は、（B）数intravasated細胞は、6日目に転移性の負担の現在の成長が予測値を超えると7日目に転移性の負担の存在として定義されている自然転移を用いて決定されます。
図6。 CAMでの転移の可視化拡大 。 GFPを発現するHEp3細胞は、発達12日目に静脈内注射した。 1日目、3日と5日に卵を屠殺され、CAMのセクションは、蛍光実体顕微鏡で画像化した。濃い緑色の背景には卵の殻によって作成され、血管系は黒線で表示されており、腫瘍細胞は、明るい緑色の斑点として表示されます。
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Discussion
ひよこCAMは、癌の生物学および転移性の進行のさまざまな側面を研究するモデル系として何十年も使用されています。転移能力の原則の評価休眠の分析を含むグループの様々なことで、このモデルで実行されている（アギーレGhiso ら 、1999;。オソウスキと帝国、1983）、組織のリモデリング（Deryugina ら 、2005;。ハーンDantona ら 、1999）、および転移（ザイルストラら 、2008;。。ザイルストラら 、2002）。。それがため、その使いやすさ、異種移植片を受け入れるためにその能力の癌の生物学にとって非常に魅力的なモデルであり続け、そしてその低コスト（Chambers ら 、1982;。Chambers ら 、1990。）。人間固有のアルミベースの定量的PCR（。。Kim ら 、1998;ザイルストラら 、2002）を使用して我々はヒトcpidermoid癌細胞株HEp3の転移性播種（図3）を分析する能力を実証する。さらに、我々は転移抑制抗体1A5を使用して治療阻害の評価にこの手法の有用性を示す（図4、（テスタら 、1999;。。ザイルストラら 、2008））。
転移能と治療反応を評価するためにできることに加えて、このモデルはまた、定量的に転移カスケード（ザイルストラら 、2002）の個々の成分を研究するために使用することができます。腫瘍細胞の静脈内注射による実験的転移を使用して、このモデルは、癌細胞の二次器官で逮捕し、彼らのその後の成長（図5A）の分析が可能になります。成長のこの率は長手方向の自然転移アッセイ（図5b）で転移性の負担を予測するために使用することができます。管内は自然転移（B）数intravasated細胞は7日目に転移性の負担の存在を引いた値、6日目に転移性の負担の現在の成長が予測さとして定義されている使用して決定されます。
。ルイスら 、技術の拡張子はここで報告したように、我々は最近、腫瘍の微小環境（レオンら 、2010を標的とする蛍光標識ナノ粒子を使用してin vivoで腫瘍細胞の挙動（。ザイルストラら 、2008）、可視化する新たな戦略を開発ら 、2006）。これらの前進の方法を通じて、このモデルの有用性は、腫瘍細胞の生存、設立と成長をサポートする複雑で動的な変化を視覚化するために悪用される可能性があります。ひよこCAMの比較的低コスト、免疫不全の性質、使いやすさ、適応性と相まって、これらの技術は、イメージングおよび癌転移の定量分析のためのこのモデルは貴重なこと。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は寛大に受精卵を提供するためのタイソンフーズ社を認識したい。シャナアーノルドは、このプロトコルの撮影の間に尽力した。 Trenisパーマーは、ルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞（F31国立がん研究所）の下に国立衛生研究所によってサポートされていました。この作品は、部分的にJDLとNIH / NCIの助成金＃CA120711 - 01A1とCA120711 - 01A1にAZにCCSRIグラント＃700537によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
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