Summary
Usando PCR quantitativo, demonstramos como o bem-estabelecida pinto modelo CAM pode ser usado para analisar quantitativamente a metástase de células tumorais para órgãos distantes.
Abstract
Durante as células do câncer disseminar metástases do tumor primário, invade os tecidos em volta, e se espalhou para órgãos distantes. Metástase é um processo complexo que pode envolver muitos tipos de tecido, períodos de tempo variável extensão, e muitas vezes ocorrem profundamente dentro dos órgãos, o que torna difícil para investigar e quantificar. Além disso, a eficácia do processo metastático é influenciado por várias etapas da cascata metastática que torna difícil avaliar a contribuição de um único aspecto do comportamento de células tumorais. Como conseqüência, os ensaios metástases são freqüentemente realizados em animais experimentais para fornecer um contexto necessariamente realistas para estudar metástase. Infelizmente, estes modelos são ainda mais complicada pela sua complexa fisiologia. O embrião de galinha é um exclusivo modelo in vivo que supera muitas limitações para estudar metástase, devido à acessibilidade da membrana corioalantóide (CAM), um tecido bem vascularizado extra-embrionárias localizado por baixo da casca do ovo que está receptivo à xeno-enxerto de células tumorais (figura 1). Além disso, desde o embrião de galinha é, naturalmente, imunodeficientes, o CAM prontamente suporta o enxerto de tecidos normais e tumorais. Mais importante, a CAM aviária com sucesso suporta características celulares mais câncer incluindo o crescimento, invasão, angiogênese e remodelação do microambiente. Isso faz com que o modelo extremamente útil para a investigação das vias que levam à metástase do câncer e para prever a resposta do câncer metastático de novas terapêuticas potenciais. A detecção de células divulgada pela espécie-específicos Alu PCR torna possível avaliar quantitativamente a metástase em órgãos que são colonizados por apenas 25 células. Usando a linha de células carcinoma epidermóide Humanos (HEp3) usamos esse modelo para analisar a metástase espontânea de células cancerosas para órgãos distantes, incluindo o fígado e pulmão pinto. Além disso, usando o protocolo Alu-PCR que demonstram a sensibilidade ea reprodutibilidade do ensaio como uma ferramenta para analisar e quantificar intravasation, parada, extravasamento, colonização e como elementos individuais de metástases.
Protocol
1. Preparar os ovos para xeno (metástase espontânea)
- Recém-punham ovos de galinha fertilizados são incubados em uma incubadora rotativa por 10 dias a 100 ° F e umidade de 60%. Os ovos são rodados quatro vezes a cada hora.
- No dia 10 de desenvolvimento dos ovos são colocados ao seu lado em um rack de ovo. Uma fonte de luz pescoço de ganso lâmpada ou outro material adequado é usado para vela os ovos brilhando a luz para a casca de ovo no final blunt do ovo onde o airsac está localizado.
- A veia corioalantóicas está localizado e marcado. Esta veia é localizada na parte superior da casca do ovo onde é a junção de vários grandes vasos sanguíneos. Neste ponto de ramificação do vaso sanguíneo cai, longe do CAM e atribui ao embrião. A caixa quadrada um centímetro é desenhado com lápis na casca de ovo de aproximadamente um centímetro de distância do ponto de ramificação na veia. A área, incluindo e ao redor da praça é então limpo com um cotonete embebido em iodo.
- Usando uma ferramenta de corte rotativa (Dremel) equipado com uma pedra de carboneto de silicone de moagem (Dremel parte # 84922) de um buraco é perfurado através da extremidade sem corte do ovo para dentro do saco de ar. Usando esta ferramenta mesmo um buraco é perfurado dentro do quadrado previamente desenhado na parte superior do ovo, parando curto da membrana da casca. A agulha da seringa de calibre 25 com uma broca fina na ponta é usada para fazer um pequeno furo na membrana da casca com cuidado para não rasgar o CAM subjacente. O CAM é posteriormente separada da membrana da casca na região da praça usando sucção gentil criado com uma ajuda pipeta automática equipada com um pedaço de tubo de tygon ¼ "colocado contra o buraco na airsac. Após a aplicação de sucção, um bolsão de ar deve debaixo do buraco na praça significando que o CAM foi removida com sucesso longe da casca de ovo. Depois que o CAM é descartado, o buraco no saco de ar e um buraco localizado na praça perto da veia corioalantóicas é selada com um pedaço de fita de laboratório fita. Os ovos são posteriormente colocadas em uma incubadora estacionária a 100 º F e umidade de 60%, em antecipação de enxertia das células tumorais. Veja a figura 1 para uma representação seqüencial.
2. Preparar os ovos para injecção intravenosa (metástase experimental)
- Recém-punham ovos de galinha fertilizados são incubados em uma incubadora rotativa por 12 dias a 100 ° F e umidade de 60%. Os ovos são rodados quatro vezes a cada hora.
- No dia 12 de desenvolvimento dos ovos são colocados ao seu lado em um rack de ovo. Uma fonte de luz pescoço de ganso lâmpada ou outro material adequado é usado para vela os ovos brilhando a luz para a casca de ovo no final blunt do ovo onde o airsac está localizado.
- A veia corioalantóicas está localizado e marcado. A um centímetro por 0,5 centímetro retângulo é desenhado com lápis na casca de ovo diretamente acima da veia. A área, incluindo e ao redor da praça é então limpo com um cotonete embebido em iodo.
- Uma pequena janela é criada na casca de ovo no local desenhado usando a broca dremmel (# 118). A janela é removida para expor a membrana de casca de ovo subjacente que é posteriormente prestados transparente com gota de óleo mineral. Ver figura 5A para uma representação gráfica.
- Neste ponto, o buraco no saco de ar e um buraco localizado na praça perto da veia corioalantóicas é selada com um pedaço de fita de laboratório fita. Os ovos são posteriormente colocadas em uma incubadora estacionária a 100 º F e umidade de 60% na expectativa de injetar as células do tumor.
3. Preparar as células tumorais para enxertia ou injeção.
- Para xeno, as células do tumor são separadas de seus pratos de cultura usando Tripsina / EDTA e lavada com 10 volumes de tampão fosfato (PBS), a fim de remover qualquer mídia residual, Tripsina, ou EDTA.
- Por via intravenosa, as células cultivadas são destacadas usando uma solução de células-dissociação não enzimática, e lavados com soro livre de DMEM. e)
- As células são contadas com um hemocitômetro e ressuspendidas em PBS a 1-40 células / ml para enxertia, ou, alternativamente, ressuspenso em DMEM sem soro, 1 milhão de células / ml solução injectável IV.
4. Enxerto as células do tumor para o CAM recém-expostas (Metástase espontânea)
- Os ovos são retirados da incubadora e uma pequena janela é cortado no local da praça previamente elaborado, onde a bolsa de ar novo formou. Isso é mais facilmente feito com uma ferramenta rotativa equipada com uma roda de corte (ferramenta Dremel com a roda de corte # 409 circular). Um par de agulha nariz fórceps é usado para remover a seção pequena de casca de ovo e expor o CAM subjacente.
- Usando um aplicador de algodão (Fisher Marca # 23-400-001) a CAM é abrasiva 5 vezes. Um pouco de sangue deve ser evidente no algodão. Imediatamente após o dano ao CAM, 25μl da suspensão de células é colocado sobre a área danificada. O número ideal de células e é determinadampirically mas pode variar de 5 a 0.5X10 1X10 6. A janela em que o ovo é hermeticamente fechadas com fita adesiva e os filhotes ficam em pé por 10-15 minutos, a fim de permitir que as células de resolver. Após 15 minutos os ovos são devolvidos à incubadora estacionário.
- Os tumores são permitidos a crescer por 5-8 dias, dependendo da aplicação específica ea natureza da linha de células tumorais utilizados. Veja a figura 1 para uma representação seqüencial.
5. Injeção intravenosa de células tumorais (metástases Experimental)
- Usando um calibre 30 100μl seringa de insulina de suspensão de células é injetado na veia alantóide de cada embrião, os ovos foram devolvidos para uma incubadora e lá permaneceu estacionária por mais 1-7 dias.
- Em momentos distintos, o pulmão ou menor CAM são colhidas de cada embrião e processados para a detecção de células tumorais, como descrito abaixo.
6. Tumores colheita e tecidos pinto
- A área de dissecção é preparado. O ensaio detecta células metastáticas através da quantificação de DNA humano através de um método altamente sensível PCR. Por isso é muito importante para evitar a contaminação com DNA exógeno. Dissecção é realizada em uma área dedicada e em todo o dissecções as ferramentas são limpos entre cada animal. , A fim de evitar a contaminação cruzada de suas amostras durante todo o processo de dissecação 3 conjuntos separados de ferramentas são utilizadas: um conjunto para cortar o ovo, um conjunto para remover o tumor primário e um conjunto para remover os órgãos internos. Além disso, quatro recipientes de lavagem são usados para lavagem de ferramentas seqüenciais entre cada animal. Na seqüência estas lavagens são: 1) de água bidestilada, 2) de água bidestilada, 3) cloro, e 4) de etanol 70%.
- Os ovos são retirados da incubadora estacionária e colocado em gelo por 15 minutos para anestesiar e sacrificar os animais. As janelas são abertas de tal forma que os tumores se tornam visíveis. Abrir as janelas maiores, removendo algumas das casca de ovo pode ser necessária. Os tumores primários são ressecadas do CAM, pesados e processados para histologia.
- O filhote é removido da casca de ovo, cortando a casca radialmente em metades iguais. O embrião é decantada a partir do shell de corte e transferido para um lado limpo da mama pesar barco para cima. O animal é dissecado com o uso de um conjunto fresco e limpo de ferramentas. O animal é aberta cortando o esterno. Uma vez que o embrião é aberta, um pedaço do fígado de qualquer lobo direita ou esquerda é coletado. Os órgãos internos são subseqüentemente removidos puxando suavemente sobre o esôfago ligado à moela e corte a visera que ligam os órgãos. A fim de recolher os pulmões cortar a caixa torácica é aberta a placa de mama é separado eo coração é removido. Neste ponto, é possível cortar em torno dos quatro lados do pulmão (parte superior mais próximo à cabeça do lado esquerdo ao longo da caixa torácica, a parte inferior perto do diafragma eo lado direito ao longo da traquéia). Por uma questão de coerência, mesmo pulmão são coletadas em cada animal. Colhidas amostras de tecido são armazenadas a -20 ° C para uso posterior, ou pode ser processado imediatamente para o isolamento de DNA.
7. Isolamento do DNA genômico e Análise de PCR quantitativo
- DNA genômico é extraído de tecidos utilizando o SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit (Sigma-Aldrich Catalog # XNATRG). O DNA extraído pode ser transferido para um tubo eppendorf limpo e armazenado a -20 ° C ou usado imediatamente. É importante para diluir o DNA 1:50 em água livre de nuclease antes de o utilizar na reação de PCR subseqüente. Alternativamente, o DNA pode ser extraído usando qualquer número de protocolos padrão de extração de DNA (Zijlstra et al., 2002).
- DNA humano é detectada nos tecidos específicos pinto usando PCR quantitativo para seqüências Alu humana. PCR quantitativo utilizando Alu-primers específicos é realizada utilizando a amplificação SYBR verde do kit Exract-N-Amp. O kit PCR vem com um mix de reação contendo SYBR 2x verde, tampão, dNTPs sais, polimerase Taq Antibody eo Jumpstart Taq. A mistura de reação é feita em um volume final de 15μl, com 0.4μM de cada primer. Para a maioria dos casos, usando o DNA extraído diluído 1:50 irá fornecer dados quantitativos, no entanto, a quantidade ideal de DNA modelo pode precisar de ser otimizado empiricamente. Primers GAPDH de frango são usados como um controle interno da PCR é executado sob as seguintes condições para seqüências Alu: ativação da polimerase a 95 ° C por 2 min, seguido por 30 ciclos de 95 ° C por 30 s., 63 ° C por 30 s. , 72 ° C por 30 s. As condições de reação para a galinha GAPDH são idênticos aos descritos para Alu no entanto pode ser necessário estender o PCR para 40 ciclos.
- Análise quantitativa de metástase é realizada usando o método ΔΔCt comparando grupos experimentais com um grupo controle (Schmittgen e Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). Alternativamente, uma curva padrão pode ser gerada através de uma série de diluição de células tumorais humanas extraídas usando o kit Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 2002). Significância estatística é avaliada utilizando teste t de Student ou Anova análise dos grupos controle e experimental.
8. Resultados representativos:
Figura 1. A galinha modelo de metástase embrião. A) Um diagrama de painel de quatro ilustrando a aparência do modelo em corte transversal em etapas fundamentais: 1. Após 10 dias de incubação. O CAM chegou próxima do máximo tamanho. As artérias e veias são claramente visíveis com a veia alantóide posicionado contra a parte superior do ovo. 2. O ovo imediatamente após a perfuração de dois furos na casca de ovo: uma para o airsac e um ao lado do ponto de fixação para a veia alantóide. 3. A aparência depois de um leve vácuo tem sido usada para evacuar o airsac e solte o CAM. Células tumorais (azul) são aplicadas ao CAM caiu. 4. Após permitir que a célula tumoral enxertados a crescer, o tumor, juntamente com os tecidos do embrião da galinha são colhidas para análise B) A representação de série do modelo: 1.. Incubar os ovos., 2. Marcando a localização da veia alantóide., 3. Furos na casca de ovo., 4. Deixar cair o CAM., 5. Cortar uma abertura para células tumorais enxertia., 6. Aplicar as células do tumor., 7. Refrigeração dos ovos em gelo antes da coleta de tecido., 8. Colhendo o tumor após 7 dias de crescimento.
Figura 2. Histologia dos tumores CAM. Tecidos retirados de membrana tendo tumor corioalantóicas foi fixada em formalina, seccionados e processados com uma mancha tricrômico. A) tumor HEp3 após sete dias de crescimento sobre a CAM. B e C mostram regiões ampliada de A mostra estroma e neoplásico. D) normals CAM.
Figura 3. Análise longitudinal quantitativa de metástase. Variantes para a cabeça e pescoço com carcinoma HEp3 alta ou baixa capacidade metastática (HEp3 M (High) e HEp3 M (Baixo), respectivamente) foram analisados por sua capacidade de disseminar o uso Alu PCR. Dez animais foram analisados em cada momento para a duração de 7 dias. Estas amostras foram quantificadas contra uma curva padrão e, posteriormente, expressa como # cells/50mg tecido.
Figura 4. A inibição de células metástase espontânea nos animais tratados com a metástase 1A5 anticorpos inibidores. Tumores foram formados com 5x10 5 células HEp3 aplicada ao CAM do dia 10 embriões. Três dias após a aplicação das células do tumor de metade dos animais foram tratados com o anticorpo anti-CD151 1A5. Os pulmões dos animais portadores de tumor foram colhidos dois dias depois e submetida a quantitativa em tempo real alu PCR. Por outro lado quantitativo PCR em tempo real de chGAPDH foi usado para confirmar a presença de quantidades equivalentes de DNA genômico host (O método ΔΔCt foi usado para comparar os dois grupos quantitativamente (B).
Figura 5. Avaliar prisão, crescimento e intravasation na cascata metastática. Fundamentalmente, a metástase para um órgão secundário é definido pelas contribuições de três aspectos: taxa de detenção, de crescimento e taxa de intravasation. Estes podem ser quantificados utilizando uma combinação de metástase experimental (A) e metástase espontânea (B). Usando metástase experimental (A) prisão é definido como o número de células detectadas após a injeção 2hr. Sobrevivência e crescimento das células preso é determinada como a mudança na célula pós-injeção número 24h. Crescimento é definida como a taxa de proliferação durante os dias 3-7. Intravasation é determinada utilizando metástase espontânea (B), onde as células intravasated número é definido como o presente ônus metastático no dia 7 que exceda o valor previsto pelo crescimento da carga metastático presentes no dia 6.
Figura 6. Expansão visualização do metastática no CAM. HEp3 células expressando GFP foram injetados por via intravenosa em 12 dias de desenvolvimento. No dia 1, 3 e 5 um ovo foi sacrificado e uma seção de CAM foi fotografada com um microscópio estéreo fluorescente. O fundo verde escura é criado por casca do ovo, a vascularização é visível como linhas pretas, e as células do tumor são visíveis como pontos luminosos verdes.
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Discussion
O CAM pinto tem sido utilizada há décadas como um sistema modelo para estudar vários aspectos da biologia e progressão do câncer metastático. Avaliação princípio da capacidade metastática foram realizados neste modelo por uma variedade de grupos, incluindo a análise de dormência (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski e Reich, 1983), remodelação do tecido (Deryugina et al, 2005;. Hahn-DANTONA . et al, 1999), e metástase (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. Ele continua a ser um modelo muito atraente para a biologia do câncer por causa de sua facilidade de uso, sua capacidade de aceitar xenoenxertos, e seu baixo custo (Chambers et al, 1982;. Chambers et al, 1990).. Usando humano específico Alu-PCR quantitativo com base (Kim et al, 1998;.. Zijlstra et al, 2002) que demonstram a capacidade de analisar disseminação metastática de linha celular humana HEp3 cpidermoid carcinoma (Figura 3). Além disso, nós demonstrar a utilidade desta técnica na avaliação da inibição da terapêutica utilizando a metástase 1A5 anticorpos inibitórios (figura 4, (Testa et al, 1999;. Zijlstra et al, 2008).).
Além de ser capaz de avaliar a capacidade metastática e resposta ao tratamento, este modelo também pode ser usado para estudar quantitativamente os componentes individuais da cascata metastática (Zijlstra et al., 2002). Usando metástase experimental pela injeção intravenosa de células do tumor, este modelo permite a análise de detenção de células cancerosas nos órgãos secundários e seu subseqüente crescimento (Figura 5A). Esta taxa de crescimento pode ser usado para prever a carga metastático em um ensaio de metástase longitudinal espontânea (Figura 5B). Intravasation é determinada utilizando metástase espontânea (B), onde as células intravasated número é definido como o presente ônus metastático no dia 7 menos o valor previsto pelo crescimento da carga metastático apresentam no dia 6.
Como uma extensão das técnicas aqui relatadas, que recentemente desenvolveu novas estratégias para visualizar o comportamento de células tumorais in vivo (Zijlstra et al, 2008.), Que utilizam nanopartículas fluorescentes marcados para atingir o microambiente do tumor (Leong et al, 2010;. Lewis et al., 2006). Através destes métodos avançando, a utilidade deste modelo pode ser explorada para visualizar as mudanças complexas e dinâmicas que suportam a sobrevivência, estabelecimento e crescimento das células tumorais. Essas tecnologias, juntamente com o custo relativamente baixo, a natureza imunodeficientes, facilidade de uso, ea adaptabilidade da CAM pinto tornar este modelo valioso para imagem e análise quantitativa de metástase de câncer.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Queremos reconhecer Tyson Foods Inc. para fornecer generosamente os ovos fertilizados. Shanna Arnold foi fundamental durante as filmagens deste protocolo. Trenis Palmer foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde sob a Kirschstein Ruth L. Prêmio Nacional de Serviço de Investigação (F31 Instituto Nacional do Câncer). Este trabalho foi parcialmente suportado pelo CCSRI Grant # 700537 para JDL e NIH / NCI conceder # CA120711-01A1-01A1 e CA120711 a AZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
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