Summary
Utilizzando la PCR quantitativa, ci dimostrano come la consolidata pulcino modello CAM può essere utilizzato per analizzare quantitativamente la metastasi di cellule tumorali in organi distanti.
Abstract
Durante le cellule tumorali metastasi disseminare dal tumore primario, invadere i tessuti circostanti, e si diffuse in organi distanti. Metastasi è un processo complesso che può coinvolgere diversi tipi di tessuto, periodi lasso di tempo variabile, e spesso si verificano in profondità all'interno degli organi, rendendo difficile indagare e quantificare. Inoltre, l'efficacia del processo metastatico è influenzato da più passaggi nella cascata metastatica rendendo difficile valutare il contributo di un singolo aspetto del comportamento delle cellule tumorali. Di conseguenza, le analisi sono eseguite frequentemente metastasi negli animali da esperimento per fornire un contesto necessariamente realistica in cui studiare metastasi. Sfortunatamente, questi modelli sono ulteriormente complicata dalla loro fisiologia complessi. L'embrione di pollo è un unico modello in vivo che supera molti limiti allo studio di metastasi, a causa della accessibilità della membrana corioallantoidea (CAM), una buona vascolarizzazione dei tessuti extra-embrionali trova sotto il guscio d'uovo che è ricettivo ai xenotrapianto di cellule tumorali (figura 1). Inoltre, poiché l'embrione di pollo è naturalmente immunodeficienti, il CAM supporta facilmente l'attecchimento dei tessuti normali e tumorali. Soprattutto, il CAM aviaria supporta con successo le caratteristiche delle cellule tumorali tra cui la maggior parte della crescita, invasione, angiogenesi, e il rimodellamento del microambiente. Questo rende il modello particolarmente utile per lo studio delle vie che portano alla metastasi del cancro e di prevedere la risposta del tumore metastatico a nuovi potenziali terapie. La rilevazione di cellule diffusi da specie-specifico Alu PCR permette di valutare quantitativamente metastasi in organi che sono colonizzati da un minimo di 25 celle. Utilizzando la linea di carcinoma epidermoide umano (HEP3) usiamo questo modello per analizzare metastasi spontanea delle cellule tumorali in organi distanti, tra cui il pulcino fegato e polmoni. Inoltre, utilizzando la Alu-PCR protocollo dimostriamo la sensibilità e la riproducibilità del test come strumento per analizzare e quantificare intravasation, arresto, stravaso, e la colonizzazione come singoli elementi di metastasi.
Protocol
1. Preparare le uova di xenotrapianto (metastasi spontanea)
- Appena deposto uova di gallina fecondate vengono incubate in un incubatore a rotazione per 10 giorni a 100 ° C e 60% di umidità. Le uova sono ruotate quattro volte ogni ora.
- Il giorno 10 di sviluppo le uova sono posti dalla loro parte in un rack uovo. Una fonte a collo d'oca lampada o un altro leggero adatto è utilizzato per le uova candela facendo brillare la luce nel guscio d'uovo alla fine ottuso dell'uovo dove si trova il airsac.
- La vena corioallantoidea si trova e segnato. Questa vena è situato nella parte superiore del guscio in cui è la giunzione di diverse grandi vasi sanguigni. A questo punto il ramo vaso sanguigno scende giù, lontano dalla CAM e attribuisce all'embrione. Una finestra di 1 centimetro quadrato è disegnato con la matita sul guscio circa 1 cm di distanza dal punto di diramazione della vena. L'area compresa e intorno alla piazza è poi puliti con un batuffolo di cotone imbevuto di iodio.
- Utilizzando uno strumento di taglio ruotante (Dremel) dotato di una pietra al carburo di silicio rettifica (parte Dremel # 84922), un buco si è esercitato attraverso l'estremità smussata dell'uovo nel sacco aria. Con questo strumento lo stesso un buco viene praticato all'interno della piazza precedentemente disegnato sopra l'uovo, fermandosi della membrana guscio d'uovo. Un 25-gauge siringa con una fresa multa alla fine è usato per fare un piccolo foro nella membrana guscio facendo attenzione a non strappare il sottostante CAM. Il CAM è successivamente staccato dalla membrana guscio d'uovo nella zona della piazza con aspirazione delicata creato con un aiuto pipetta automatica dotata di un pezzo di ¼ "tubo Tygon posto dopo il buco nel airsac. Al momento l'applicazione di aspirazione, una sacca d'aria devono sotto il buco nella piazza che significa che la CAM è stata con successo caduto dal guscio d'uovo. Dopo la CAM è caduto, il buco nel sacco aereo e il foro situato nella piazza vicino alla vena corioallantoidea è sigillata con un pezzo di nastro nastro di laboratorio. Le uova vengono successivamente inserite in un incubatore fisso a 100 ° C e 60% di umidità in attesa del trapianto delle cellule tumorali. Si veda la figura 1 per una rappresentazione sequenziale.
2. Preparare le uova per iniezione endovenosa (metastasi sperimentale)
- Appena deposto uova di gallina fecondate vengono incubate in un incubatore a rotazione per 12 giorni a 100 ° C e 60% di umidità. Le uova sono ruotate quattro volte ogni ora.
- Il giorno 12 di sviluppo le uova sono posti dalla loro parte in un rack uovo. Una fonte a collo d'oca lampada o un altro leggero adatto è utilizzato per le uova candela facendo brillare la luce nel guscio d'uovo alla fine ottuso dell'uovo dove si trova il airsac.
- La vena corioallantoidea si trova e segnato. Un rettangolo di 1 centimetro di 0,5 cm è disegnato con matita sul guscio direttamente sopra la vena. L'area compresa e intorno alla piazza è poi puliti con un batuffolo di cotone imbevuto di iodio.
- Una piccola finestra viene creata nel guscio d'uovo nel percorso disegnato con la punta Dremmel (# 118). La finestra viene rimossa per esporre la membrana sottostante guscio d'uovo che viene successivamente reso trasparente con una goccia di olio minerale. Vedi 5A figura per una rappresentazione grafica.
- A questo punto il buco nel sacco aereo e il foro situato nella piazza vicino alla vena corioallantoidea è sigillata con un pezzo di nastro nastro di laboratorio. Le uova vengono successivamente inserite in un incubatore fisso a 100 ° C e 60% di umidità in previsione di iniettare le cellule tumorali.
3. Preparazione cellule tumorali per l'innesto o iniezione.
- Per xenotrapianto, le cellule tumorali si staccano dalla loro piatti dalla cultura utilizzando tripsina / EDTA e lavate con 10 volumi di tampone fosfato (PBS) al fine di rimuovere tutti i supporti residuo, tripsina, o EDTA.
- Per iniezione endovenosa, cellule in coltura sono staccati utilizzando cellule dissociazione non enzimatica soluzione, e lavato con DMEM senza siero. e)
- Le cellule sono contati con un emocitometro e risospese in PBS a 1-40 cellule / ml per l'innesto, o in alternativa risospese in DMEM senza siero a 1 milione di cellule / ml per iniezione ev.
4. L'innesto delle cellule tumorali sul esposte di recente CAM (metastasi spontanee)
- Le uova vengono rimossi dal termostato e una piccola finestra è tagliata nella posizione della piazza precedentemente disegnato dove la bolla d'aria nuova si è formata. Ciò è più facilmente realizzabile con un utensile rotante dotato di una rotella di taglio (utensili Dremel con il # 409 ruota di taglio circolare). Un paio di pinze ad ago naso viene utilizzato per rimuovere la piccola sezione di guscio d'uovo e di esporre il CAM sottostante.
- Utilizzando un cotone con punta applicatore (Brand Fisher # 23-400-001) la CAM è abrasa 5 volte. Un po 'di sangue dovrebbe essere evidente sul cotone. Immediatamente dopo danneggiare il CAM, 25μl di sospensione cellulare viene posizionato sulla zona danneggiata. Il numero ottimale di cellule è determinato empirically ma può variare da 5 a 0.5x10 1X10 6. La finestra nel uovo è ben sigillati con nastro adesivo ed i pulcini sono rimasti in piedi per 10-15 minuti in modo da consentire alle cellule di regolare. Dopo 15 minuti le uova vengono restituiti al fermo incubatrice.
- I tumori sono permesso di crescere per 5-8 giorni a seconda della specifica applicazione e la natura della linea di cellule tumorali utilizzati. Si veda la figura 1 per una rappresentazione sequenziale.
5. Iniezione endovenosa di cellule tumorali (metastasi Sperimentale)
- Utilizzando un contatore 30 100μl siringa di insulina di sospensione cellulare viene iniettata nella vena allantoide di ogni embrione, le uova sono stati restituiti ad un incubatore stazionaria e vi rimase per altri 1-7 giorni.
- In momenti distinti, il polmone o inferiore CAM vengono raccolte da ogni embrione e trattati per l'individuazione delle cellule tumorali, come descritto di seguito.
6. Tumori raccolta e tessuti pulcino
- Una zona dissezione è preparato. Il test rileva cellule metastatiche da quantificare il DNA umano con un approccio altamente sensibile della PCR. E 'quindi molto importante per evitare la contaminazione con il DNA esogeno. Dissezioni vengono eseguiti in un'area dedicata e in tutto il dissezioni gli strumenti sono puliti tra ogni animale. Al fine di prevenire la contaminazione incrociata dei campioni di tutto il processo di dissezione 3 insiemi separati di strumenti sono utilizzati: un set per tagliare l'uovo, uno per la rimozione del tumore primario e uno per la rimozione degli organi interni. Inoltre, quattro contenitori sono usati per lavare sequenziale risciacquo di strumenti tra ogni animale. In sequenza queste soluzioni di lavaggio sono: 1) Acqua bidistillata, 2) acqua bidistillata, 3) candeggina e 4) 70% di etanolo.
- Le uova vengono rimossi dal fermo incubatore e messo in ghiaccio per 15 minuti per anestetizzare gli animali e eutanasia. Le finestre sono aperte in modo che i tumori diventano visibili. Aprire le finestre più grandi, rimuovendo alcune delle guscio può essere necessario. I tumori primari sono resecati dal CAM, pesato, e trattati per istologia.
- Il pulcino è rimosso dal guscio d'uovo tagliando il guscio radialmente in due metà uguali. L'embrione viene decantato dalla shell taglio e trasferito in una parte pulita del seno barca soppesare. L'animale è sezionato con l'utilizzo di un nuovo, pulito serie di strumenti. L'animale è aperta con il taglio dello sterno. Una volta che l'embrione è aperta, un pezzo del fegato sia dal lobo destro o sinistro viene raccolto. Gli organi interni sono successivamente rimosso tirando delicatamente l'esofago collegato al ventriglio e il taglio del visera che collegano gli organi. Al fine di raccogliere i polmoni tagliare la cassa toracica è aperta la piastra del seno è separata e il cuore è stato rimosso. A questo punto è possibile tagliare intorno ai quattro lati del polmone (la parte superiore più vicina alla testa sul lato sinistro lungo la gabbia toracica, la parte inferiore vicino al diaframma e il lato destro lungo la trachea). Per motivi di coerenza, il polmone stesso è raccolto in ogni animale. Campioni di tessuto raccolte sono conservati a -20 ° C per un uso successivo o possono essere trattati immediatamente per l'isolamento di DNA.
7. Isolamento del DNA genomico e analisi PCR quantitativa
- Il DNA genomico viene estratto dai tessuti utilizzando il SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit (Sigma-Aldrich Catalogo # XNATRG). Il DNA estratto può essere trasferito in una provetta pulita eppendorf e conservati a -20 ° C o utilizzato immediatamente. E 'importante per diluire il DNA 1:50 in acqua priva di nucleasi prima di utilizzarlo nella successiva reazione di PCR. In alternativa, il DNA può essere estratto con un qualsiasi numero di protocolli standard di estrazione del DNA (Zijlstra et al., 2002).
- Il DNA umano è rilevato nei tessuti pulcino con PCR quantitativa specifica per l'uomo sequenze Alu. PCR quantitativa utilizzando Alu-primer specifico viene eseguita utilizzando l'amplificazione SYBR green dal exract-N-Amp kit. Il kit PCR viene fornito con una miscela di reazione contenente 2x SYBR green, tampone, sali dNTP, Taq polimerasi e l'anticorpo Jumpstart Taq. La miscela di reazione è costituita in un volume finale di 15μl, con 0.4μM di ciascun primer. Per la maggior parte dei casi utilizzando il DNA estratto diluito 1:50 fornirà dati quantitativi, tuttavia, la quantità ottimale di DNA stampo può essere necessario ottimizzare empiricamente. Pollo primer GAPDH sono utilizzati come controllo interno è gestito La PCR nelle seguenti condizioni per le sequenze Alu: attivazione della polimerasi a 95 ° C per 2 minuti seguiti da 30 cicli a 95 ° C per 30 secondi, 63 ° C per 30 s. , 72 ° C per 30 s. Le condizioni di reazione per il pollo GAPDH sono identiche a quelle descritte per Alu tuttavia, può essere necessario estendere la PCR a 40 cicli.
- L'analisi quantitativa di metastasi viene eseguita utilizzando il metodo del confronto ΔΔCt gruppi sperimentali ad un gruppo di controllo (Schmittgen e Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). In alternativa una curva standard può essere generato usando una serie di diluizioni di cellule tumorali umane estratte utilizzando il Extract-N-Amp Kit (Zijlstra et al., 2002). La significatività statistica viene valutata utilizzando Student t-test o analisi Anova di controllo e di gruppi sperimentali.
8. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Il modello di embrione di pollo metastasi. A) Un pannello di quattro diagramma illustra l'aspetto del modello in sezione trasversale a fasi principali: 1. Dopo 10 giorni di incubazione. Il CAM ha raggiunto quasi le dimensioni massime. Le arterie e le vene sono nettamente visibili con la vena allantoide posizionato contro la parte superiore dell'uovo. 2. L'uovo subito dopo la foratura due fori nel guscio d'uovo: uno nell'altro airsac e adiacente al punto di attacco per la vena allantoideo uno. 3. L'aspetto dopo un vuoto dolce è stato utilizzato per evacuare l'airsac e rilasciare il CAM. Cellule tumorali (blu) vengono applicate alla CAM caduto. 4. Dopo aver consentito al innestato cellule tumorali a crescere, il tumore con tessuti dai embrione di pollo vengono raccolti per l'analisi B) Una rappresentazione di serie del modello: 1.. L'incubazione delle uova., 2. Segnando la posizione della vena allantoide., 3. I fori nel guscio d'uovo., 4. Cadere la CAM., 5. Taglio di apertura per l'innesto delle cellule tumorali., 6. Applicando le cellule tumorali., 7. Raffreddamento le uova sul ghiaccio prima della raccolta del tessuto., 8. La raccolta del tumore dopo 7 giorni di crescita.
Figura 2. Istologia dei tumori CAM. I tessuti prelevati da membrana cuscinetto tumore corioallantoidea è stato fissato in formalina, sezionati e trattati con una macchia tricromica. A) HEP3 tumore dopo sette giorni di crescita sul CAM. B e C mostrano regioni magnificato dalla A mostrare sia del tumore e stroma. D) normali CAM.
Figura 3. Analisi quantitativa longitudinale di metastasi. Varianti per la testa e il collo con carcinoma HEP3 alta o bassa capacità metastatica (HEP3 M (High) e HEP3 M (basso), rispettivamente) sono stati analizzati per la loro capacità di diffondere tramite Alu PCR. Dieci animali sono stati analizzati in ogni punto volta per la durata di 7 giorni. Questi campioni sono stati quantificati contro una curva standard e successivamente espressa # cells/50mg tessuti.
Figura 4. L'inibizione delle cellule metastasi spontanee negli animali trattati con l'anticorpo 1A5 inibire le metastasi. I tumori si sono formati utilizzando 5X10 5 HEP3 cellule applicato al CAM del giorno-10 embrioni. Tre giorni dopo l'applicazione delle cellule tumorali sono state trattate metà degli animali con l'anticorpo anti-CD151 1A5. I polmoni di animali portatori di tumore sono state raccolte due giorni dopo e sottoposto a restrizioni quantitative real-time PCR alluminio. Al contrario quantitativa real-time PCR di chGAPDH è stata utilizzata per confermare la presenza di quantità equivalenti di DNA genomico ospite (ΔΔCt Il metodo è stato utilizzato per confrontare i due gruppi quantitativamente (B).
Figura 5. Valutare l'arresto, la crescita, e intravasation nella cascata metastatica. Fondamentalmente, le metastasi di un organo secondario è definito dal contributo di tre aspetti: l'arresto, il tasso di crescita, e il tasso di intravasation. Questi possono essere quantificati utilizzando una combinazione di metastasi sperimentali (A) e metastasi spontanee (B). Utilizzando metastasi sperimentali (A) è definito come l'arresto del numero di cellule rilevate 2 ore dopo l'iniezione. Sopravvivenza e la crescita delle cellule arrestato è determinato come la variazione di iniezione numero di cellule 24 ore dopo. La crescita è definito come il tasso di proliferazione nei giorni 3-7. Intravasation è determinato utilizzando metastasi spontanee (B), dove il numero di cellule intravasated è definito come l'attuale carico metastatico il giorno 7 che supera il valore previsto dalla crescita degli oneri metastatico presenti il giorno 6.
Figura 6. Espansione visualizzazione delle metastasi nel CAM. HEP3 cellule che esprimono GFP sono state iniettate per via endovenosa in 12 giorni di sviluppo. Il giorno 1, 3 e 5 è stato sacrificato un uovo e una sezione di CAM è stato ripreso con uno stereo microscopio a fluorescenza. Lo sfondo verde scuro viene creata dal guscio d'uovo, il sistema vascolare è visibile come linee nere, e le cellule tumorali sono visibili come macchie verdi brillanti.
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Discussion
Il CAM pulcino è stato utilizzato per decenni come sistema modello per studiare vari aspetti della biologia del cancro e nella progressione metastatica. Valutazione principio della capacità metastatica sono stati effettuati in questo modello da una varietà di gruppi, tra cui l'analisi di dormienza (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski e Reich, 1983), rimodellamento dei tessuti (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999), e le metastasi (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. Continua ad essere un modello molto interessante per la biologia del cancro a causa della sua facilità d'uso, la sua capacità di accettare xenotrapianti, e il suo basso costo (Chambers et al, 1982;. Chambers et al, 1990).. Utilizzando umano specifico Alu-based PCR quantitativa (Kim et al, 1998;.. Zijlstra et al, 2002) abbiamo dimostrato la capacità di analizzare diffusione metastatica delle cellule umane di carcinoma linea cpidermoid HEP3 (Figura 3). Inoltre abbiamo dimostrato l'utilità di questa tecnica nella valutazione di inibizione terapeutico usando la inibitorio 1A5 anticorpi metastasi (figura 4, (Testa et al, 1999;. Zijlstra et al, 2008).).
Oltre ad essere in grado di valutare la capacità metastatica e risposta al trattamento, questo modello può anche essere utilizzato per studiare quantitativamente i singoli componenti della cascata metastatica (Zijlstra et al., 2002). Utilizzando metastasi sperimentali mediante iniezione endovenosa di cellule tumorali, questo modello consente l'analisi di arresto delle cellule del cancro negli organi secondari e la loro successiva crescita (figura 5A). Questo tasso di crescita può essere utilizzato per prevedere l'onere metastatico in un test di metastasi spontanea longitudinale (figura 5B). Intravasation è determinato utilizzando metastasi spontanee (B), dove il numero di cellule intravasated è definito come l'attuale carico metastatico il giorno 7 meno il valore previsto dalla crescita del presente carico metastatico il giorno 6.
Come estensione delle tecniche qui riportate, abbiamo recentemente sviluppato nuove strategie per visualizzare il comportamento delle cellule tumorali in vivo (Zijlstra et al, 2008.), Che utilizzano nanoparticelle fluorescente di indirizzare il microambiente tumorale (Leong et al, 2010;. Lewis et al., 2006). Grazie a questi metodi che avanza, l'utilità di questo modello può essere sfruttato per visualizzare i cambiamenti complessi e dinamici che supportano la creazione, la sopravvivenza e la crescita delle cellule tumorali. Queste tecnologie, insieme con il costo relativamente basso, la natura immunodeficienti, facilità d'uso, e l'adattabilità della CAM pulcino rendono questo modello valido per l'imaging e l'analisi quantitativa delle metastasi del cancro.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vogliamo riconoscere Tyson Foods Inc. per offrire generosamente le uova fecondate. Shanna Arnold è stato fondamentale durante le riprese di questo protocollo. Trenis Palmer è stato sostenuto dal National Institutes of Health sotto il Premio L. Ruth Kirschstein Servizio Nazionale delle Ricerche (F31 National Cancer Institute). Questo lavoro è stato parzialmente supportato da CCSRI di Grant # 700537 di JDL e NIH / NCI concedere # CA120711-01A1-01A1 e CA120711 ad AZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
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