Summary
Met behulp van kwantitatieve PCR, we zien hoe de gevestigde chick CAM-model kan worden gebruikt om kwantitatief analyseren van de uitzaaiing van menselijke tumorcellen naar verre organen.
Abstract
Tijdens de metastase verspreiden kankercellen uit de primaire tumor, binnen te dringen in de omliggende weefsels, en de verspreiding naar verre organen. Metastase is een complex proces dat kan gaan om vele soorten weefsel, overspanning variabele periodes en zich vaak diep in organen, waardoor het moeilijk te onderzoeken en te kwantificeren. Bovendien is de effectiviteit van de metastatische proces beïnvloed door de verschillende stappen in de metastatische cascade waardoor het moeilijk is om de bijdrage van een enkel aspect van de tumor cel gedrag te evalueren. Als gevolg hiervan zijn metastase testen vaak uitgevoerd in proefdieren om een realistische context noodzakelijk om in te studeren metastase te bieden. Helaas zijn deze modellen nog verder gecompliceerd door hun complexe fysiologie. Het kuiken embryo is een uniek in vivo model dat veel beperkingen overwint aan het bestuderen van metastase, te wijten aan de bereikbaarheid van de chorion-membraan (CAM), een goed gevasculariseerd extra-embryonaal weefsel bevindt zich onder de eierschaal die ontvankelijk is voor de xenografting van tumorcellen (figuur 1). Aangezien het kuiken embryo is natuurlijk immunodeficiënte, de CAM ondersteunt gemakkelijk de innesteling van zowel de normale en tumor weefsel. Het belangrijkste is dat het aviaire CAM ondersteunt met succes de meeste kankercellen kenmerken, zoals groei, invasie, angiogenese, en herinrichting van de micro-omgeving. Dit maakt het model bijzonder nuttig voor het onderzoek van de routes die leiden tot kanker metastase en de reactie van uitgezaaide kanker aan nieuwe potentiële geneesmiddelen te voorspellen. De detectie van verspreide cellen door soortspecifieke Alu PCR maakt het mogelijk om kwantitatief te beoordelen uitzaaiingen in organen die zijn gekoloniseerd door zo weinig als 25 cellen. Met behulp van de Human epidermoïde carcinoom cellijn (HEp3) gebruiken we dit model tot spontane uitzaaiing van kankercellen te analyseren naar verre organen, waaronder het kuiken lever en longen. Bovendien, met behulp van de Alu-PCR-protocol tonen we aan de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de test als een instrument voor het analyseren en intravasation, arrestatie, extravasatie, en kolonisatie te kwantificeren als individuele elementen van metastase.
Protocol
1. De voorbereiding van de eieren voor xenografting (spontane metastase)
- Vers gelegde bevruchte kippen eieren worden uitgebroed in een roterende incubator voor 10 dagen bij 100 ° C en 60% luchtvochtigheid. De eieren worden gedraaid vier keer per uur.
- Op de ontwikkeling dag 10 worden de eieren gelegd op hun kant in een ei rack. Een zwanenhals lamp of een andere geschikte lichtbron wordt gebruikt om kaarsen van de eieren door schijnt het licht in de eierschaal aan het stompe eind van het ei waar de airsac zich bevindt.
- Het chorion ader zich bevindt en gemarkeerd. Deze ader bevindt zich aan de bovenkant van de eierschaal waar het de kruising van enkele grote bloedvaten. Op deze tak moment het bloedvat druppels naar beneden, weg van de CAM en hecht aan het embryo. Een 1 cm vierkante doos is getekend met potlood op de eischaal ongeveer 1 cm afstand van de tak punt in de ader. Het gebied met inbegrip van en rond het plein wordt vervolgens gereinigd met behulp van een wattenstaafje gedrenkt in jodium.
- Met behulp van een roterend snijgereedschap (Dremel) voorzien van een siliconen carbide slijpsteen (Dremel deel # 84922) wordt een gat geboord door het stompe eind van het ei in de luchtzak. Met behulp van deze zelfde gereedschap een gat geboord in de eerder getrokken vierkant op de top van het ei, het stoppen van korte van de eischaal membraan. Een 25-gauge-naald met een fijne boor aan het uiteinde wordt gebruikt om een klein gaatje te maken in de eischaal membraan en let niet op de onderliggende CAM scheuren. De CAM wordt vervolgens losgekoppeld van de eierschaal membraan op het gebied van het plein met behulp van zachte zuigkracht gemaakt met een automatische pipet hulp uitgerust met een stuk van ¼ "Tygon slang geplaatst tegen het gat in de airsac. Bij de af te zuigen, moet een luchtbel onder het gat in het plein betekent dat de CAM met succes is gedaald afstand van de eierschaal. Nadat de cam is gedaald, is het gat in de lucht zak en het gat in het plein bij het chorion ader afgesloten met een stuk tape laboratorium tape. De eieren worden vervolgens geplaatst in een stationaire incubator bij 100 ° C en 60% luchtvochtigheid in afwachting van enten de tumorcellen. Zie figuur 1 voor een sequentiële weergave.
2. De voorbereiding van de eieren voor intraveneuze injectie (experimenteel metastase)
- Vers gelegde bevruchte kippen eieren worden uitgebroed in een roterende incubator gedurende 12 dagen bij 100 ° C en 60% luchtvochtigheid. De eieren worden gedraaid vier keer per uur.
- Op de ontwikkeling dag 12 worden de eieren gelegd op hun kant in een ei rack. Een zwanenhals lamp of een andere geschikte lichtbron wordt gebruikt om kaarsen van de eieren door schijnt het licht in de eierschaal aan het stompe eind van het ei waar de airsac zich bevindt.
- Het chorion ader zich bevindt en gemarkeerd. Een 1 cm met 0,5 cm rechthoek is getekend met potlood op de eierschaal direct boven de ader. Het gebied met inbegrip van en rond het plein wordt vervolgens gereinigd met behulp van een wattenstaafje gedrenkt in jodium.
- Een klein venster wordt aangemaakt in de eierschaal in het getekende locatie met de Dremmel boor (# 118). Het venster is verwijderd om het onderliggende eischaal membraan, die vervolgens wordt weergegeven transparant met daling van minerale olie bloot te leggen. Zie figuur 5A voor een grafische weergave.
- Op dit punt het gat in de lucht zak en het gat in het plein bij het chorion-ader is afgesloten met een stuk tape laboratorium tape. De eieren worden vervolgens geplaatst in een stationaire incubator bij 100 ° C en 60% luchtvochtigheid in afwachting van het inspuiten van de tumorcellen.
3. Voorbereiden tumorcellen zijn voor transplantatie of injectie.
- Voor xenografting, worden de tumorcellen los van uit hun eigen cultuur gerechten met trypsine / EDTA en gewassen met 10 volumes van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om eventuele resterende media, trypsine, of EDTA te verwijderen.
- Voor IV injectie, zijn gekweekte cellen losgemaakt met behulp van niet-enzymatische cel-dissociatie-oplossing, en gewassen met serum-vrij DMEM. en)
- Cellen worden geteld met een hemacytometer en geresuspendeerd in PBS bij 10 tot 40 miljoen cellen / ml voor transplantatie, of als alternatief opnieuw gesuspendeerd in serum-vrij DMEM op 1 miljoen cellen / ml voor intraveneuze injectie.
4. Enten de tumor cellen op de nieuw blootgesteld CAM (Spontaan metastase)
- De eieren worden verwijderd uit de incubator en een klein venster is gesneden in de plaats van de eerder getrokken plein waar de nieuwe luchtbel heeft gevormd. Dit is het meest eenvoudig te doen met een roterend gereedschap is uitgerust met een snij-wiel (Dremel tool met de # 409 ronde snijden wiel). Een paar van de naald-neus tang wordt gebruikt om het kleine gedeelte van de eierschaal te verwijderen en de onderliggende CAM bloot te leggen.
- Met behulp van een wattenstaafje (Fisher Brand # 23-400-001) de cam is afgesleten 5 keer. Een beetje bloed moet blijken op het katoen. Onmiddellijk na beschadiging van het CAM, is 25μl van de celsuspensie geplaatst op het beschadigde gebied. Het optimale aantal cellen wordt bepaald empirically maar kan variëren van 5 tot 0.5X10 1x10 6. Het venster in het ei is goed afgesloten met tape en de kuikens zijn blijven staan gedurende 10-15 minuten, zodat de cellen om zich te vestigen. Na 15 minuten de eieren worden teruggegeven aan de stationaire incubator.
- De tumoren kunnen groeien voor 5-8 dagen, afhankelijk van de specifieke toepassing en de aard van de tumor gebruikte cellijn. Zie figuur 1 voor een sequentiële weergave.
5. Intraveneuze injectie van tumorcellen (Experimental metastase)
- Met behulp van een 30 Gauge insuline spuit 100μl celsuspensie wordt geïnjecteerd in de allantoïs ader van elk embryo, werden de eieren terug naar een stationaire incubator en bleef daar voor een extra 1-7 dagen.
- Op verschillende tijdstippen, zijn de longen of lagere CAM geoogst uit ieder embryo en bewerkt voor het opsporen van tumorcellen, zoals hieronder beschreven.
6. Oogsten tumoren en chick weefsels
- Een dissectie gebied wordt voorbereid. De test detecteert metastatische cellen door het kwantificeren van het menselijk DNA met behulp van een zeer gevoelige PCR-benadering. Het is daarom erg belangrijk om te voorkomen dat besmetting met exogeen DNA. Dissecties worden uitgevoerd in een speciale ruimte en gedurende de dissecties de gereedschappen zijn schoongemaakt tussen elke dier. Een set voor het snijden van het ei, een set voor het verwijderen van de primaire tumor en een set voor het verwijderen van de interne organen: om kruisbesmetting van uw monsternemingen gedurende het hele proces dissectie drie aparte sets van instrumenten worden gebruikt te voorkomen. Daarnaast worden vier wassen containers gebruikt voor sequentiële spoelen van gereedschappen tussen elk dier. In volgorde van deze wasbeurten zijn: 1) dubbel gedestilleerd water, 2) dubbel gedestilleerd water, 3) chloor, en 4) 70% ethanol.
- De eieren worden verwijderd uit de stationaire incubator en op ijs geplaatst gedurende 15 minuten te verdoven en laten inslapen van de dieren. De ramen worden geopend, zodat de tumoren zichtbaar worden. Het openen van de vensters groter door het verwijderen van een deel van de eierschaal kan nodig zijn. De primaire tumoren zijn weggesneden uit het CAM, gewogen en verwerkt voor histologie.
- Het kuiken wordt verwijderd uit de eierschaal door het snijden van de shell radiaal in twee gelijke helften. Het embryo is gedecanteerd van de snede shell en overgebracht naar een schone wegen boot borst naar boven. Het dier wordt ontleed met behulp van een frisse, schone set van tools. Het dier wordt geopend door dwars door het borstbeen. Zodra het embryo is geopend, een stukje van de lever van zowel de rechter of linker kwab is verzameld. De interne organen worden vervolgens verwijderd door te trekken voorzichtig aan de slokdarm aan de spiermaag en snijden van de visera dat de organen aan te sluiten. Voor het verzamelen van longen, snijd de ribbenkast wordt geopend de borst plaat is gescheiden en het hart is verwijderd. Op dit punt is het mogelijk te snijden rond de vier zijden van de long (de top het dichtst bij het hoofd van de linker kant langs de ribbenkast, de onderste in de buurt van het diafragma en de rechterkant langs de luchtpijp). Omwille van de consistentie wordt dezelfde long verzameld in ieder dier. Geoogst weefselmonsters worden bewaard bij -20 ° C voor later gebruik of kunnen direct worden verwerkt voor DNA-isolatie.
7. Genomisch DNA isolatie en kwantitatieve PCR-analyse
- Genomisch DNA wordt geëxtraheerd uit weefsels met behulp van de SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit (Sigma-Aldrich Catalog # XNATRG). Het geëxtraheerde DNA kan worden overgedragen aan een schoon eppendorfbuisje en opgeslagen bij -20 ° C of onmiddellijk wordt gebruikt. Het is belangrijk om het DNA 1:50 verdunnen in nuclease gratis water alvorens het te gebruiken in de volgende PCR-reactie. Als alternatief kan DNA worden gehaald met behulp van een aantal standaard DNA-extractie protocols (Zijlstra et al.., 2002).
- Menselijk DNA is aangetroffen in het kuiken weefsels met behulp van kwantitatieve PCR specifiek voor menselijk Alu sequenties. Kwantitatieve PCR met behulp van Alu-specifieke primers wordt uitgevoerd met behulp van de SYBR groen versterking van de Exract-N-Amp kit. De PCR kit wordt geleverd met een 2x reactie mix met SYBR groen, buffer, zouten dNTP, Taq-polymerase en de Jumpstart Taq antilichaam. De reactie mix is opgebouwd in een uiteindelijk volume van 15μl, met 0.4μM van elke primer. Voor de meeste gevallen het gebruik van de geëxtraheerde DNA verdund 01:50 zullen kwantitatieve gegevens te verstrekken, maar kan de optimale hoeveelheid van het template-DNA moeten empirisch worden geoptimaliseerd. Kip GAPDH primers worden gebruikt als een interne controle De PCR is onder de volgende voorwaarden lopen Alu sequenties: polymerase activering bij 95 ° C gedurende 2 minuten gevolgd door 30 cycli bij 95 ° C gedurende 30 seconden, 63 ° C gedurende 30 s. , 72 ° C gedurende 30 s. De reactieomstandigheden voor kip GAPDH zijn identiek aan die beschreven voor Alu maar het kan nodig zijn om de PCR uit te breiden tot 40 cycli.
- Kwantitatieve analyse van metastase wordt uitgevoerd met behulp van de methode ΔΔCt vergelijken experimentele groepen aan een controlegroep (Schmittgen en Livak, 2008;. Zijlstra et al., 2002). U kunt ook een standaard curve kan worden gegenereerd met behulp van een verdunningsreeks van humane tumorcellen geëxtraheerd met behulp van de Extract-N-Amp kit (Zijlstra et al.., 2002). Statistische significantie is geëvalueerd aan de hand Student T-test of ANOVA-analyse van de controle en experimentele groep.
8. Representatieve resultaten:
Figuur 1. De kip embryo metastase model. A) Een vier-paneel diagram illustreert het uiterlijk van het model in dwarsdoorsnede op belangrijke stappen: 1. Na 10 dagen incubatie. De CAM heeft bereikt bijna maximale grootte. De slagaders en aders zijn duidelijk zichtbaar met het allantoïs ader geplaatst tegen de bovenkant van het ei. 2. Het ei onmiddellijk na het boren van twee gaten in de eierschaal: een in de airsac en een grenzend aan het bevestigingspunt voor het allantoïs ader. 3. Het uiterlijk na een mild vacuüm is gebruikt om de airsac evacueren en de CAM te laten vallen. Tumorcellen (blauw) worden toegepast op de gevallen CAM. 4. Na aftrek van de geënte tumorcel om te groeien, zijn de tumor samen met de weefsels van de kip embryo geoogst voor analyse B) Een seriële voorstelling van het model: 1.. Incubatie van de eieren., 2. Markeren de locatie van de allantoïs ader., 3. Het boren van gaten in de eierschaal., 4. Het schrappen van de CAM., 5. Snij een opening voor tumorcel enten., 6. Toepassing van de tumorcellen., 7. Koelen van de eieren op ijs voorafgaand aan het verzamelen van weefsel., 8. Het oogsten van de tumor na 7 dagen van de groei.
Figuur 2. Histologie van CAM tumoren. Weefselmonsters van tumor dragende chorion membraan werd gefixeerd in formaline, coupes en verwerkt met een trichroomkleuring vlek. A) HEp3 tumor na zeven dagen van groei op de CAM. B en C tonen vergroot regio's van A toont zowel de tumor en stroma. D) normalen CAM.
Figuur 3. Kwantitatieve longitudinale analyse van metastase. Varianten voor het hoofd en de nek carcinoom HEp3 met een hoge of lage metastatische vermogen (HEp3 M (Hoog) en HEp3 M (Low) respectievelijk) werden geanalyseerd op hun vermogen om te verspreiden met behulp van PCR Alu. Tien dieren werden geanalyseerd op elk tijdstip voor de duur van 7 dagen. Deze monsters werden gekwantificeerd tegen een standaard curve en vervolgens uitgedrukt als # cells/50mg weefsel.
Figuur 4. De remming van de spontane metastase cellen bij dieren die behandeld werden met de uitzaaiingen remmen antilichaam 1A5. Tumoren werden gevormd met behulp van 5x10 5 HEp3 cellen toegepast op de CAM van de dag-10 embryo's. Drie dagen na het aanbrengen van de tumorcellen de helft van de dieren werden behandeld met de anti-CD151 antistof 1A5. De longen van de tumor-dragende dieren werden twee dagen later geoogst en onderworpen aan kwantitatieve real-time PCR alu. Omgekeerd kwantitatieve real-time PCR van chGAPDH werd gebruikt om de aanwezigheid van equivalente hoeveelheden van gastheer genomisch DNA (De ΔΔCt methode werd gebruikt om kwantitatief vergelijken van de twee groepen (B) te bevestigen.
Figuur 5. Het evalueren van arrestatie, de groei, en intravasation in de metastatische cascade. Fundamenteel, is metastase naar een secundaire orgel bepaald door de bijdragen van drie aspecten: arrestatie, de snelheid van de groei, en de snelheid van intravasation. Deze kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een combinatie van experimentele metastase (A) en spontane metastase (B). Met behulp van experimentele metastase (A) gearresteerd wordt gedefinieerd als het aantal cellen ontdekt 2 uur na de injectie. Overleving en de groei van cellen gearresteerd wordt bepaald als de verandering in het aantal cellen 24 uur na de injectie. Groei is gedefinieerd als de mate van proliferatie tijdens dag 3-7. Intravasation wordt bepaald met behulp van spontane metastase (B) waar het aantal intravasated cellen wordt gedefinieerd als de metastatische last aanwezig op dag 7, dat hoger is dan de voorspelde waarde door de groei van de metastatische last aanwezig op dag 6.
Figuur 6. Visualiseren van de uitbreiding van de metastatische in de CAM. HEp3 cellen die GFP werden intraveneus geïnjecteerd op de ontwikkeling dag 12. Op dag 1, 3, 5 en een ei werd opgeofferd en een deel van de CAM was afgebeeld met een tl-stereo-microscoop. De donkere groene achtergrond wordt gemaakt door de eierschaal, het vaatstelsel wordt zichtbaar als zwarte lijnen, en de tumor cellen zijn zichtbaar als heldere groene vlekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De chick CAM is gebruikt voor decennia als een modelsysteem om de verschillende aspecten van kanker biologie en metastatische progressie te bestuderen. Principe evaluatie van gemetastaseerd vaardigheden zijn uitgevoerd in dit model door een verscheidenheid van groepen, waaronder de analyse van de rusttoestand (Aguirre Ghiso et al., 1999;. Ossowski en Reich, 1983), remodellering van het weefsel (Deryugina et al., 2005;. Hahn-Dantona . et al., 1999), en metastase (Zijlstra et al., 2008;. Zijlstra et al., 2002).. Het blijft een zeer aantrekkelijk model voor kanker biologie vanwege het gebruiksgemak, de mogelijkheid om xenotransplantaten te accepteren, en de lage kosten (Chambers et al., 1982;. Chambers et al., 1990.). Gebruik van menselijke specifieke Alu-op basis van kwantitatieve PCR (Kim et al., 1998;.. Zijlstra et al., 2002) tonen we de mogelijkheid om metastatische verspreiding van de menselijke cpidermoid carcinoma cellijn HEp3 (figuur 3) te analyseren. Daarnaast tonen we het nut van deze techniek bij de evaluatie van de therapeutische remming het gebruik van de metastase remmende antilichaam 1A5 (figuur 4, (Testa et al., 1999;. Zijlstra et al., 2008).).
Naast de mogelijkheid om de evaluatie van uitgezaaide vermogen en respons op de behandeling, dit model ook gebruikt kan worden om kwantitatief onderzoek naar afzonderlijke componenten van de metastatische cascade (Zijlstra et al.., 2002). Met behulp van experimentele metastase door intraveneuze injectie van tumorcellen, dit model zorgt voor de analyse van de kankercel arrestatie in de secundaire organen en hun verdere groei (figuur 5A). Deze groei kan worden gebruikt om de uitgezaaide belasting in de lengterichting spontane metastase assay (figuur 5B) te voorspellen. Intravasation wordt bepaald met behulp van spontane metastase (B) waar het aantal intravasated cellen wordt gedefinieerd als de metastatische last aanwezig op dag 7 minus de waarde voorspeld door de groei van de uitgezaaide last aanwezig op dag 6.
In het verlengde van de technieken die hier worden gerapporteerd, hebben we onlangs ontwikkelde nieuwe strategieën om de tumor cel gedrag in vivo (Zijlstra et al., 2008.), Die fluorescent gelabelde nanodeeltjes gebruiken om de tumor micro-omgeving (Leong et al., 2010 gestelde doel te visualiseren;. Lewis et al., 2006).. Door deze voortschrijdende methodes, kan het nut van dit model worden benut om de complexe en dynamische veranderingen die het overleven, de vestiging en de groei van tumorcellen te ondersteunen visualiseren. Deze technologieën, in combinatie met de relatief lage kosten, immunodeficiënte karakter, gebruiksgemak, en het aanpassingsvermogen van het kuiken CAM maken dit model waardevol voor beeldvorming en kwantitatieve analyse van kanker metastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen Tyson Foods Inc erkennen voor ruim het verstrekken van de bevruchte eieren. Shanna Arnold speelde een belangrijke rol tijdens de opnames van dit protocol. Trenis Palmer werd gesteund door de National Institutes of Health onder de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F31 National Cancer Institute). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door CCSRI Grant # 700537 om JDL en NIH / NCI verlenen # CA120711-01A1-01A1 en CA120711 naar AZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
