Summary
באמצעות PCR כמותי, אנו מדגימים כיצד המודל ומבוססת חומוס CAM ניתן להשתמש כדי לנתח את כמותית גרורות של תאים סרטניים אנושיים לאיברים רחוקים.
Abstract
במהלך תאים סרטניים להפיץ גרורות מהגידול הראשוני, לפלוש לתוך הרקמות הסובבות, ומתפשטים לאיברים מרוחקים. גרורה היא תהליך מורכב זה יכול לערב סוגי רקמות רבות, בתקופות משך הזמן משתנה, ולעתים קרובות להתרחש עמוק בתוך איברים, ולכן קשה לחקור ולכמת. בנוסף, יעילות תהליך גרורתי מושפעת שלבים מרובים מפל גרורתית ולכן קשה להעריך את התרומה של היבט אחד של התנהגות תאים סרטניים. כתוצאה מכך, מבחני גרורות מבוצעות לעתים קרובות בחיות מעבדה לספק בהכרח בהקשר מציאותי שבו ללמוד גרורות. למרבה הצער, אלה הם מודלים מורכבים יותר על ידי הפיזיולוגיה המורכבת שלהם. עובר אפרוח הוא מודל ייחודי vivo כי מתגבר על מגבלות רבות ללימוד גרורות, בשל הנגישות של קרום chorioallantoic (רמ"א), היטב vascularized חוץ עובריים רקמות הממוקמת מתחת קליפת כי הוא פתוח xenografting של תאים סרטניים (איור 1). יתר על כן, מאז הוא עובר אפרוח immunodeficient טבעי, CAM בקלות תומך engraftment של רקמות הן נורמליות הגידול. והחשוב מכל, CAM העופות בהצלחה תומך המאפיינים תאים סרטניים ביותר כולל צמיחה, פלישה, אנגיוגנזה, שיפוץ של microenvironment. זה הופך את המודל שימושי במיוחד לצורך חקירה של מסלולים שיובילו גרורות סרטן כדי לחזות את התגובה של סרטן גרורתי כדי הרפוי פוטנציאליים חדשים. זיהוי של תאים המופץ על ידי מינים ספציפיים Alu PCR מאפשרת להעריך כמותית גרורות לאיברים כי הם יישבו על ידי כמה כמו 25 תאים. באמצעות קו קרצינומה האדם Epidermoid תא (HEp3) אנו משתמשים במודל זה כדי לנתח גרורות ספונטנית של תאים סרטניים לאיברים רחוקים, כולל הכבד חומוס ריאות. יתר על כן, באמצעות פרוטוקול Alu-PCR אנו מדגימים את רגישות שחזור של assay ככלי לניתוח לכמת, intravasation מעצר, extravasation, והקולוניזציה כמו אלמנטים בודדים של גרורות.
Protocol
1. הכנת ביצים xenografting (גרורות ספונטנית)
- טרי הניח ביצים עוף מופרית מודגרת בתוך חממה מסתובב במשך 10 ימים ב 100 ° F ולחות 60%. ביצים הן מסובבות ארבע פעמים בכל שעה.
- ביום התפתחותי 10 ביצים ממוקמים בצד שלהם במעמד ביצה. מקור אווז צוואר המנורה או אחרת אור מתאים משמש נר את הביצים על ידי זוהר אור לתוך קליפת בסוף בוטה של הביצה שבה airsac ממוקם.
- וריד chorioallantoic ממוקם ומסומן. וריד זה ממוקם בחלק העליון של קליפת הביצה שבה הוא צומת של מספר כלי דם גדולים. בשלב זה ענף כלי דם יורד למטה, הרחק CAM ומתחבר העובר. תיבת ריבוע 1cm מצוייר בעפרון על קליפת כ 1cm הרחק מנקודת סניף הווריד. האזור כולל סביב הכיכר הוא ניקה ואז באמצעות מקלון צמר גפן טבול יוד.
- באמצעות כלי חיתוך מסתובבת (Dremel) מצויד אבן סיליקון קרביד שחיקה (חלק Dremel # 84922) הוא קדח חור דרך בקצה הקהה של הביצה אל שק אוויר. באמצעות כלי זה אותו הוא קדח חור בתוך הריבוע נמשך קודם לכן על גבי הביצה, עצירת קצר של קרום קליפת הביצה. מחט מד 25-מזרק עם ספחת קנס על קצה היא נהגה להכין חור קטן בקרום קליפת נזהרים שלא לקרוע את CAM הבסיסית. CAM היא מנותקת לאחר מכן מן קרום קליפת באזור הכיכר באמצעות שאיבה עדינה שנוצרו בעזרת פיפטה אוטומטית מצויד לצינור ¼ tygon "להציב מול החור airsac. עם החלת יניקה, כיס אוויר מתחת צריך החור בכיכר המסמנים כי CAM הופל בהצלחה הרחק קליפת הביצה. לאחר CAM הוא ירד, החור שק האוויר ואת החור ממוקם בכיכר ליד הווריד chorioallantoic אטום עם חתיכת סרט מעבדה הקלטת. הביצים מוטלות לאחר מכן ב 100 ° F ולחות 60% לתוך חממה נייח לקראת השתלת תאים סרטניים. ראה איור 1 עבור תיאור רציף.
2. הכנת ביצים הזרקה תוך ורידית (גרורות ניסיוני)
- טרי הניח ביצים עוף מופרית מודגרת בתוך חממה מסתובב במשך 12 ימים 100 ° F ולחות 60%. ביצים הן מסובבות ארבע פעמים בכל שעה.
- ביום התפתחותי 12 ביצים ממוקמים בצד שלהם במעמד ביצה. מקור אווז צוואר המנורה או אחרת אור מתאים משמש נר את הביצים על ידי זוהר אור לתוך קליפת בסוף בוטה של הביצה שבה airsac ממוקם.
- וריד chorioallantoic ממוקם ומסומן. 1cm על ידי מלבן 0.5 ס"מ מצוירת בעיפרון על קליפת הביצה ישירות מעל הווריד. האזור כולל סביב הכיכר הוא ניקה ואז באמצעות מקלון צמר גפן טבול יוד.
- חלון קטן נוצרת קליפת במיקום נמשך באמצעות המקדח Dremmel (# 118). החלון מוסר לחשוף את קרום קליפת הבסיסית אשר מוצג לאחר מכן שקוף עם טיפה של שמן מינרלי. ראה 5A הנתון תיאור גרפי.
- בשלב זה החור שק האוויר ואת החור ממוקם בכיכר ליד הווריד chorioallantoic אטום עם חתיכת סרט מעבדה הקלטת. הביצים מוטלות לאחר מכן ב 100 ° F ולחות 60% לתוך חממה נייח לקראת הזרקת תאים סרטניים.
3. הכנת תאים סרטניים עבור השתלת או בהזרקה.
- עבור xenografting, תאים את הגידול מנותקים מן הכלים התרבות שלהם באמצעות טריפסין / EDTA ורחץ עם 10 כרכים של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) על מנת להסיר כל התקשורת שיורית, טריפסין, או EDTA.
- עבור זריקה IV, תאים בתרבית מנותקים באמצעות פתרון nonenzymatic התא דיסוציאציה, ורחץ עם סרום ללא DMEM. ו)
- תאים נספרים עם hemacytometer ו resuspended ב PBS ב 1-40 תאים / מ"ל עבור השתלת, או לחילופין resuspended ב 1 מיליון תאים / מ"ל להזרקה IV בסרום ללא DMEM.
4. השתלת תאים סרטניים אל CAM שנחשפו לאחרונה (גרורה ספונטנית)
- הביצים יוסרו מן החממה ואת חלון קטן הוא חתך במיקום הכיכר נמשך בעבר שבו כיס אוויר חדש נוצר. הדבר נעשה בקלות עם כלי רוטרי מצויד גלגל חיתוך (כלי Dremel עם גלגל חיתוך עגול 409 #). צמד של מחט מלקחיים האף משמש כדי להסיר את קטע קטן של קליפת ולחשוף את CAM הבסיסית.
- באמצעות מטוש צמר גפן שקצהו (מותג פישר # 23-400-001) CAM היא הכתה 5 פעמים. קצת דם צריך להיות ברור על הכותנה. מיד לאחר פגיעה CAM, 25μl ההשעיה התא ממוקם על שטח פגום. מספר אופטימלי של תאים הדואר נקבעmpirically אבל יכול לנוע בין 5 ל 0.5X10 1x10 6. החלון ביצה היא סגורה היטב עם קלטת האפרוחים נשארים עומדים במשך 10-15 דקות על מנת לאפשר לתאים להתיישב. לאחר 15 דקות הביצים מוחזרים החממה נייח.
- גידולים מותר לגדול במשך 5-8 ימים בהתאם ליישום ספציפי ואת אופי של קו תאים סרטניים בשימוש. ראה איור 1 עבור תיאור רציף.
5. הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים (גרורות ניסויית)
- באמצעות מד מזרק אינסולין 30 100μl ההשעיה תא מוזרק לתוך הווריד allantoic של העובר כל הביצים הוחזרו חממה נייח ונשאר שם במשך 1-7 ימים נוספים.
- בנקודות זמן שונות, הריאות או CAM נמוך נקצרים מעובר כל מעובד לצורך זיהוי של תאים סרטניים, כמתואר להלן.
6. גידולים מסיק ורקמות חומוס
- אזור לנתיחה מוכן. Assay מזהה תאים גרורתי על ידי לכימות DNA אנושי באמצעות גישה רגישה PCR. לכן חשוב מאוד על מנת למנוע זיהום חיצוני עם ה-DNA. והניתוחים מבוצעים בשטח ייעודי ברחבי והניתוחים הכלים מנקים בין כל חיה. על מנת למנוע זיהום צולבות של דגימות שלך לאורך כל תהליך לנתיחה 3 סטים נפרדים של כלים משמשים: קבוצה אחת לחיתוך את הביצה, סט אחד להסרת הגידול הראשוני ו סט אחד של הסרת איברים פנימיים. בנוסף, ארבעה מיכלי לשטוף משמשים רציפים שטיפה של כלים בין כל חיה. בתוך רצף שוטף אלה הם: 1) מים מזוקקים כפול, 2) מים מזוקקים פעמיים, 3) תמיסת כלור, ו 4) 70% אתנול.
- הביצים יוסרו מן האינקובטור נייחים דגש על קרח במשך 15 דקות כדי להרדים ו להרדים את החיות. החלונות נפתחים כך הגידולים להיות גלוי. פתיחת חלונות גדולים יותר על ידי הסרת חלק קליפת הביצה עשוי להיות נחוץ. הגידולים העיקריים הם resected מ CAM, שקל, ומעובד היסטולוגיה.
- חומוס יוסר קליפת הביצה על ידי חיתוך המעטפת רדיאלית לשני חצאים שווים. העובר הוא יצק מן הקליפה לחתוך והועברו צד השד נקי לשקול הסירה. היא חיה עם גזור באמצעות מערך טרי, נקי של כלים. חיה נפתח על ידי חיתוך דרך עצם החזה. לאחר העובר פתוח, חתיכת הכבד משני האונה הימנית או השמאלית נאסף. איברים פנימיים מוסרים לאחר מכן על ידי משיכת בעדינות על הוושט מחוברת קורקבן ועל קיצוץ visera המחברים את האיברים. על מנת לאסוף את הריאות לחתוך כלוב הצלעות הוא פתח את צלחת השד מופרדת ואת הלב מוסר. בשלב זה אפשר לחתוך סביב ארבעת הצדדים של הריאה (העליון הקרוב בראש הצד השמאלי לאורך כלוב הצלעות, החלק התחתון ליד הסרעפת בצד ימין לאורך קנה הנשימה). לשם עקביות, הריאות באותו נאסף כל חיה. דגימות רקמה שנקטפו מאוחסנים ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר או יכול להיות מעובד מיד לבידוד DNA.
7. בידוד DNA הגנום כמותי ניתוח PCR
- הדנ"א הגנומי מופק באמצעות רקמות הירוק חלץ Sybr-N-Amp רקמות PCR Kit (סיגמא אולדריץ קטלוג # XNATRG). הדנ"א מופק ניתן להעביר צינור Eppendorf נקי המאוחסן -20 ° C או להשתמש מיד. חשוב לדלל את ה-DNA 1:50 במים nuclease חינם לפני השימוש בו בתגובת PCR הבאים. לחילופין, ה-DNA ניתן לחלץ באמצעות מספר כלשהו של תקן החילוץ פרוטוקולי ה-DNA (Zijlstra et al., 2002).
- ה-DNA האנושי מתגלה ברקמות חומוס באמצעות PCR כמותי מסוים עבור האדם רצפי Alu. באמצעות PCR כמותי Alu ספציפי primers מתבצע באמצעות הגברה ירוק SYBR מתיק Exract-N-Amp. ערכת ה-PCR מגיעה עם תערובת תגובה 2x המכיל SYBR ירוק, חיץ, dNTPS מלחים, פולימראז תקי ואת נוגדן תקי Jumpstart. לערבב התגובה מורכב בכרך האחרון של 15μl, עם 0.4μM של כל פריימר. ברוב המקרים באמצעות DNA חילוץ בדילול 01:50 תספק נתונים כמותיים, לעומת זאת, כמות אופטימלית של ה-DNA עשויה התבנית צריך להיות מותאם באופן אמפירי. עוף primers GAPDH משמשים בקרה פנימית PCR היא לפעול תחת התנאים הבאים עבור רצפי Alu: הפעלת פולימראז על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואחריו 30 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 ש ', 63 ° C למשך 30 s. , 72 ° C למשך 30 s. תנאי תגובה עבור עוף GAPDH זהים לאלה המתוארים עבור Alu אולם ייתכן שיהיה צורך להרחיב את ה-PCR ל -40 מחזורים.
- ניתוח כמותי של גרורות מתבצע בשיטת ΔΔCt השוואת קבוצות הניסוי לקבוצת הביקורת (Schmittgen ו Livak, 2008;. Zijlstra ואח', 2002). לחילופין עקומת סטנדרט ניתן להפיק באמצעות סדרה דילול של תאים סרטניים אנושיים חילוץ באמצעות חלץ-N-Amp Kit (Zijlstra et al., 2002). משמעות סטטיסטיים מוערך באמצעות Student T-test או ניתוח אנובה השליטה קבוצות הניסוי.
8. נציג תוצאות:
באיור 1. העובר עוף גרורות במודל. א) תרשים פאנל four הממחישות את המראה של הדגם חתך בבית שלבים עיקריים: 1. לאחר 10 ימי דגירה. CAM הגיע כמעט הגודל המרבי. העורקים והוורידים נראים בבירור עם הווריד Allantoic נגד ממוצבת העליון של הביצה. 2. הביצה מיד לאחר קידוח שני חורים קליפת הביצה: האחד לתוך airsac ואחד סמוך לנקודת ההתקשרות על הווריד allantoic. 3. המראה לאחר ואקום קל נעשה שימוש כדי לפנות את airsac ושחרר את CAM. תאים סרטניים (כחול) מוחלים CAM ירד. 4. לאחר המאפשר תאים סרטניים מורכבים לגדול, יחד עם הגידול והרקמות מעובר העוף נקצרים לניתוח B) תיאור סדרתי של המודל: 1.. דוגרים על הביצים., 2. סימון המיקום של הווריד allantoic., 3. קידוח חורים קליפת הביצה., 4. הפלת CAM., 5. חיתוך פתח השתלת תאים סרטניים., 6. יישום תאים סרטניים., 7. קירור את הביצים על הקרח לפני איסוף רקמות., 8. מסיק את הגידול לאחר 7 ימים של צמיחה.
איור 2. היסטולוגיה של גידולים CAM. רקמות שנלקחו קרום נושאות הגידול chorioallantoic נקבע בפורמלין, מחולק ומעובד עם כתם trichrome. א) HEp3 הגידול לאחר שבעה ימים של צמיחה על CAM. B ו-C להראות אזורים מוגדל מן stroma הן הגידול מראה. ד) הנורמלים CAM.
איור 3. ניתוח האורך כמותי של גרורות. גרסאות עבור הראש קרצינומה HEp3 הצוואר עם היכולת גרורתי גבוה או נמוך (HEp3 M (גבוהה) ו HEp3 M (נמוכה) בהתאמה) נותחו על יכולתם להפיץ באמצעות Alu PCR. עשרת החיות נותחו בכל נקודת זמן למשך 7 ימים. דגימות אלה היו לכמת נגד עקומת סטנדרט והביע לאחר מכן כמו # cells/50mg רקמות.
איור 4. עיכוב של תאים גרורות ספונטנית חיות שטופלו 1A5 גרורות עיכוב נוגדן. גידולים שנוצרו באמצעות 5X10 5 HEp3 תאים להחיל CAM היום-10 עוברים. שלושה ימים לאחר החלת תאים סרטניים במחצית חיות שטופלו נוגדן אנטי CD151 1A5. הריאות מן הגידול נושאות חיות נבצרו כעבור יומיים נתון כמותי בזמן אמת Alu PCR. כמותי לעומת זאת בזמן אמת PCR של chGAPDH שימש לאשר את קיומו של כמויות שוות ערך של הדנ"א הגנומי מארח (שיטת ΔΔCt שימש להשוות את שתי הקבוצות כמותית (B).
איור 5. הערכת מעצר, צמיחה, intravasation במפל גרורתי. ביסודו של דבר, גרורות לאיבר משנית מוגדרת על ידי תרומות של שלושה היבטים: מעצר שיעור הצמיחה, שיעור intravasation. אלה ניתן לכמת באמצעות שילוב של גרורות ניסיוני (א) ו גרורות ספונטנית (B). שימוש ניסיוני גרורות (א) מעצר מוגדר כמספר התא זוהה הזרקת הודעה 2hr. הישרדות וצמיחה של תאים נעצר נקבע השינוי במספר הזרקת תא שלאחר 24 שעות ביממה. צמיחה מוגדרת בשיעור של התפשטות בימים 3-7. Intravasation נקבעת באמצעות גרורות ספונטנית (ב) שבו מספר תאים intravasated מוגדר להציג את הנטל גרורתי ביום 7 העולה על הערך החזוי על ידי צמיחה של הנטל גרורתי להציג ביום 6.
איור 6. הרחבת חזותי של גרורתי CAM. HEp3 תאים להביע GFP היו מוזרק לווריד על 12 יום התפתחותית. ב 1 יום, 3 ו 5 ביצה הוקרב וקטע CAM היה צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. על רקע ירוק כהה נוצר על ידי קליפת הביצה, vasculature גלוי כקווים שחורים, ועל תאים סרטניים נראים כמו כתמים ירוקים בהירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAM חומוס שימש במשך עשרות שנים כמודל למערכת ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה בסרטן גרורתי התקדמות. הערכה עקרון היכולות גרורתי בוצעו במודל זה על ידי מגוון של קבוצות, כולל ניתוח של תרדמת (אגירה Ghiso et al, 1999;. Ossowski ו רייך, 1983), שיפוץ רקמות (Deryugina et al, 2005;. האן-Dantona . et al, 1999), גרורות (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. הוא ממשיך להיות דוגמנית מאוד אטרקטיבי עבור הביולוגיה סרטן בשל קלות השימוש, יכולתו לקבל xenografts, והעלות הנמוכה (Chambers et al, 1982;. Chambers et al, 1990).. באמצעות אדם ספציפי Alu מבוססי PCR כמותי (Kim et al, 1998;.. Zijlstra et al, 2002) אנחנו מדגימים את היכולת לנתח הפצת גרורתי של האדם שורת תאים cpidermoid קרצינומה HEp3 (איור 3). בנוסף אנו מדגימים את השירות של טכניקה זו בהערכת עיכוב טיפול באמצעות נוגדנים מעכבים גרורות 1A5 (איור 4, (טסטה et al, 1999;. Zijlstra et al, 2008).).
בנוסף כדי להיות מסוגל להעריך את היכולת גרורתי ותגובה לטיפול, מודל זה גם יכול לשמש כדי לחקור כמותית רכיבים בודדים של מפל גרורתי (Zijlstra et al., 2002). שימוש ניסיוני גרורות על ידי הזרקה תוך ורידית של תאים סרטניים, מודל זה מאפשר ניתוח של סרטן תא מעצר האיברים משני וצמיחה הבאים שלהם (5A דמות). שיעור זה של גידול ניתן להשתמש כדי לחזות את הנטל גרורתי assay גרורות האורך ספונטנית (5B דמות). Intravasation נקבעת באמצעות גרורות ספונטנית (ב) שבו מספר תאים intravasated מוגדר להציג את הנטל גרורתי ביום 7 מינוס הערך החזוי על ידי צמיחה של ההווה נטל גרורתי ביום 6.
כמו הרחבה של טכניקות דיווחו כאן, שפיתחנו לאחרונה אסטרטגיות רומן לחזות התנהגות תאים סרטניים in vivo (Zijlstra et al, 2008.), אשר השימוש חלקיקים שכותרתו fluorescently ליעד microenvironment הגידול (Leong et al, 2010;. לואיס ואח al. 2006). באמצעות שיטות אלה לקידום, השירות של מודל זה ניתן לנצל כדי לחזות את השינויים מורכבים ודינמיים התומכים, הקמת הישרדות וצמיחה של תאים סרטניים. טכנולוגיות אלה, יחד עם עלות נמוכה יחסית, טבע immunodeficient, קלות שימוש, והתאמה של CAM חומוס דגם זה יקר עבור הדמיה ניתוח כמותי של גרורות סרטניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנחנו רוצים להכיר טייסון פודס בע"מ עבור בנדיבות לספק את הביציות המופרות. שארמה ארנולד סייעה במהלך הסרטה של פרוטוקול זה. Trenis פאלמר נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת L. רות פרס Kirschstein הלאומית למחקר שירות (F31 המכון הלאומי לסרטן). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי CCSRI גרנט # 700537 כדי JDL NIH ו / NCI מענק # CA120711 ו-01A1-01A1 CA120711 ל AZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
