Summary
मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके, हम प्रदर्शन कैसे अच्छी तरह से स्थापित लड़की सांचा मॉडल मात्रात्मक दूर के अंगों को मानव ट्यूमर कोशिकाओं की मेटास्टेसिस का विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. Xenografting के लिए अंडे (सहज मेटास्टेसिस) की तैयारी
- हौसले रखी निषेचित चिकन अंडे एक rotating इनक्यूबेटर में 100 ° एफ पर 10 दिन और 60% आर्द्रता के लिए incubated हैं. अंडे हर घंटे में चार बार घुमाया जाता है.
- विकास के 10 दिन में अंडे उनके पक्ष में एक अंडा रैक में रखा जाता है. एक हंस गर्दन चिराग या अन्य उपयुक्त प्रकाश स्रोत eggshell में अंडे जहां airsac स्थित है कुंद अंत में प्रकाश चमक द्वारा अंडे मोमबत्ती के लिए इस्तेमाल किया है.
- chorioallantoic नस में स्थित है और चिह्नित. यह नस eggshell है जहां यह कई बड़े रक्त वाहिकाओं के जंक्शन के शीर्ष पर स्थित है. इस शाखा बिंदु पर रक्त वाहिका नीचे बूँदें, सीएएम से दूर और भ्रूण को देता है. एक 1cm वर्ग बॉक्स eggshell पर पेंसिल के साथ तैयार की नस में शाखा बिंदु से लगभग 1cm दूर. सहित चौराहे के आसपास के क्षेत्र में तो एक कपास आयोडीन में भिगो झाड़ू का उपयोग करते हुए साफ किया जाता है.
- एक rotating काटने (Dremel उपकरण) एक सिलिकॉन कार्बाइड (Dremel भाग # 84,922) पीस पत्थर अंडे की कुंद अंत के माध्यम से हवा की थैली में एक छेद drilled के साथ फिट का उपयोग करना. यह एक ही उपकरण का उपयोग करना अंडे के शीर्ष पर पहले से तैयार वर्ग के भीतर एक छेद drilled है, eggshell झिल्ली से कम रोक. एक 25 गेज अंत पर ठीक बर के साथ सिरिंज सुई eggshell झिल्ली में अंतर्निहित सीएएम आँसू नहीं सावधान किया जा रहा एक छोटा सा छेद बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. सीएएम बाद में कोमल चूषण एक स्वचालित विंदुक airsac में छेद के खिलाफ रखा ¼ "tygon टयूबिंग की एक टुकड़ा के साथ फिट सहायता के साथ बनाया का उपयोग कर वर्ग के क्षेत्र में eggshell झिल्ली से अलग है. चूषण लागू करने पर, एक हवा जेब वर्ग में छेद के नीचे वाचक कि सीएएम सफलतापूर्वक किया गया है eggshell से दूर गिरा दिया जाना चाहिए. सीएएम के बाद गिरा दिया है, हवा की थैली और chorioallantoic नस निकट वर्ग में स्थित छेद में छेद टेप प्रयोगशाला टेप का एक टुकड़ा के साथ बंद है. अंडे बाद में 100 ° एफ और 60% आर्द्रता पर कर रहे हैं ट्यूमर कोशिकाओं को कलम बांधने का काम करने की प्रत्याशा में एक स्थिर इनक्यूबेटर में रखा. एक अनुक्रमिक चित्रण के लिए 1 आंकड़ा देखें.
2. अंतःशिरा इंजेक्शन के लिए अंडे की तैयारी (प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस)
- हौसले रखी निषेचित चिकन अंडे एक rotating इनक्यूबेटर में 100 ° एफ पर 12 दिन और 60% आर्द्रता के लिए incubated हैं. अंडे हर घंटे में चार बार घुमाया जाता है.
- विकासात्मक दिन 12 अंडे उनके पक्ष में एक अंडा रैक में रखा जाता है. एक हंस गर्दन चिराग या अन्य उपयुक्त प्रकाश स्रोत eggshell में अंडे जहां airsac स्थित है कुंद अंत में प्रकाश चमक द्वारा अंडे मोमबत्ती के लिए इस्तेमाल किया है.
- chorioallantoic नस में स्थित है और चिह्नित. 0.5 सेमी आयत द्वारा एक 1cm नस सीधे ऊपर eggshell पर पेंसिल के साथ तैयार है. सहित चौराहे के आसपास के क्षेत्र में तो एक कपास आयोडीन में भिगो झाड़ू का उपयोग करते हुए साफ किया जाता है.
- एक छोटी सी खिड़की तैयार Dremmel ड्रिल बिट (118 #) का उपयोग स्थान में eggshell में बनाया है. विंडो अंतर्निहित eggshell झिल्ली जो बाद में खनिज तेल की बूंद के साथ पारदर्शी प्रदान की गई है बेनकाब करने के लिए निकाल दिया जाता है. एक ग्राफिकल चित्रण के लिए आंकड़ा 5A देखें.
- इस बिंदु पर हवा की थैली में छेद और छेद chorioallantoic नस निकट वर्ग में स्थित टेप प्रयोगशाला टेप का एक टुकड़ा के साथ बंद है. अंडे बाद में 100 ° एफ और 60% आर्द्रता पर कर रहे हैं ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने की प्रत्याशा में एक स्थिर इनक्यूबेटर में रखा.
3. कलम बांधने का काम या इंजेक्शन के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की तैयारी.
- Xenografting के लिए, उनकी संस्कृति trypsin / EDTA का उपयोग व्यंजनों से ट्यूमर कोशिकाओं से अलग हैं और फॉस्फेट के 10 संस्करणों के साथ धोया खारा buffered (पीबीएस) के क्रम में किसी भी अवशिष्ट मीडिया, trypsin, या EDTA निकालने.
- चतुर्थ इंजेक्शन के लिए, संवर्धित कोशिकाओं nonenzymatic समाधान सेल - हदबंदी का उपयोग अलग हैं, और सीरम मुक्त DMEM के साथ धोया. और)
- कक्ष एक hemacytometer के साथ गिना जाता है और कलम बांधने का काम के लिए 10-40 मिलियन कोशिकाओं / एमएल पीबीएस में resuspended, या वैकल्पिक रूप से चतुर्थ इंजेक्शन के लिए 1 मिलियन कोशिकाओं / मिलीलीटर पर सीरम मुक्त DMEM में resuspended.
4. नव उजागर सीएएम (स्वतःस्फूर्त मेटास्टेसिस) पर ट्यूमर कोशिकाओं कलम बांधने का काम
- अंडे इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं और एक छोटी सी खिड़की पहले से तैयार वर्ग जहां नई हवा जेब का गठन किया है के स्थान में कट जाता है. यह सबसे आसानी से एक रोटरी एक काटने पहिया (# 409 परिपत्र काटने पहिया के साथ Dremel उपकरण) के साथ सुसज्जित उपकरण के साथ किया जाता है. सुई - नाक संदंश की एक जोड़ी eggshell के छोटे अनुभाग निकालने के लिए और अंतर्निहित सीएएम बेनकाब करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- एक applicator कपास इत्तला दे दी (फिशर ब्रांड # 23-400-001) का प्रयोग सांचा 5 बार abraded है. एक छोटी सी रक्त कपास पर स्पष्ट किया जाना चाहिए. सीएएम हानिकारक के तुरंत बाद, सेल निलंबन के 25μl क्षतिग्रस्त क्षेत्र पर रखा गया है. कोशिकाओं के इष्टतम संख्या निर्धारित ई हैmpirically लेकिन 0.5X10 5 से 6 1x10 रेंज अंडे विंडो में कसकर टेप के साथ बंद है और लड़कियों 10-15 मिनट के लिए खड़े करने में कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं छोड़ दिया जाता है कर सकते हैं.. 15 मिनट के बाद अंडे स्थिर इनक्यूबेटर को लौट रहे हैं.
- ट्यूमर के लिए 5-8 दिन के लिए विशिष्ट अनुप्रयोग और ट्यूमर सेल लाइन इस्तेमाल किया की प्रकृति पर निर्भर करता है बढ़ने की अनुमति दी जाती है. एक अनुक्रमिक चित्रण के लिए 1 आंकड़ा देखें.
5. ट्यूमर कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन (प्रायोगिक मेटास्टेसिस)
- सेल निलंबन की एक 30 गेज इंसुलिन सिरिंज 100μl का प्रयोग प्रत्येक भ्रूण के allantoic नस में इंजेक्शन है, अंडे एक स्थिर इनक्यूबेटर करने के लिए लौट रहे थे और एक अतिरिक्त 1-7 दिनों के लिए वहां बने रहे.
- अलग समय बिंदुओं पर, फेफड़ों या कम सीएएम प्रत्येक भ्रूण से harvested रहे हैं और ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए संसाधित, के रूप में नीचे वर्णित है.
6. फसल काटने वाले ट्यूमर और लड़की ऊतकों
- एक विच्छेदन क्षेत्र तैयार है. परख मानव डीएनए बढ़ाता एक बेहद संवेदनशील पीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग करके metastatic कोशिकाओं का पता लगाता है. इसलिए यह बहुत महत्वपूर्ण है exogenous डीएनए के साथ प्रदूषण को रोकने के के लिए. Dissections एक समर्पित क्षेत्र में प्रदर्शन कर रहे हैं और dissections भर उपकरण प्रत्येक जानवर के बीच में साफ कर रहे हैं. अंडे काटने, आंतरिक अंगों को हटाने के लिए प्राथमिक ट्यूमर और एक सेट को हटाने के लिए एक सेट के लिए एक सेट: आदेश में अपने नमूने के पार संदूषण विच्छेदन की प्रक्रिया भर में उपयोग किया जाता है उपकरणों के 3 अलग सेट को रोकने के लिए. इसके अलावा, चार धोने कंटेनर प्रत्येक जानवर के बीच उपकरणों के अनुक्रमिक rinsing के लिए उपयोग किया जाता है. 1 डबल) आसुत जल, 2) दोहरा आसुत जल, 3) क्लोरीन ब्लीच, और 4) 70% इथेनॉल: अनुक्रम में इन washes हैं.
- अंडे स्थिर इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं और anesthetize और जानवरों euthanize 15 मिनट के लिए बर्फ पर रखा है. खिड़कियों ऐसी है कि ट्यूमर दृश्यमान हो खोल रहे हैं. Eggshell के कुछ को हटाने के द्वारा बड़ी खिड़कियां खोलना आवश्यक हो सकता है है. प्राथमिक ट्यूमर सीएएम से resected हैं, तौल, और ऊतक विज्ञान के लिए संसाधित.
- लड़की eggshell से त्रिज्यात खोल बराबर हिस्सों में काटने के द्वारा हटा दिया जाता है. भ्रूण कटौती खोल से decanted है और एक साफ वजन नाव स्तन पक्ष अप करने के लिए हस्तांतरित. जानवर उपकरणों की एक ताजा, साफ सेट का उपयोग कर के साथ dissected है. जानवर उरोस्थि के माध्यम से काटने के द्वारा खोला है. एक बार भ्रूण खुला है, या तो सही है या छोड़ दिया पालि एकत्र किया जाता है से जिगर का एक टुकड़ा है. आंतरिक अंगों बाद कंठ से जुड़ी घुटकी पर धीरे खींच और visera है कि अंगों कनेक्ट काटने से हटा रहे हैं. आदेश में इकट्ठा करने के लिए फेफड़ों में कटौती रिब पिंजरे खोला जाता है स्तन प्लेट अलग है और दिल निकाल दिया जाता है. इस बिंदु पर यह संभव है करने के लिए फेफड़ों के चार पक्षों के आसपास कटौती (निकटतम सिर करने के लिए शीर्ष रिब पिंजरे, डायाफ्राम और ट्रेकिआ के साथ दाईं ओर के पास नीचे के साथ बाईं ओर). निरंतरता के लिए, एक ही फेफड़ों के प्रत्येक जानवर में एकत्र किया जाता है. काटा ऊतकों के नमूनों -20 डिग्री सेल्सियस पर बाद में उपयोग के लिए संग्रहित कर रहे हैं या डीएनए अलगाव के लिए तुरंत कार्रवाई की जा सकता है.
7. जीनोमिक डीएनए अलगाव और मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण
- जीनोमिक डीएनए Sybr ग्रीन निकालें एन Amp ऊतक पीसीआर किट (कैटलॉग सिग्मा Aldrich XNATRG #) का उपयोग ऊतकों से निकाली गई है. निकाले डीएनए एक स्वच्छ Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरित किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या तुरंत इस्तेमाल किया. यह महत्वपूर्ण है 1:50 डीएनए nuclease मुफ्त पानी में यह बाद पीसीआर प्रतिक्रिया में का उपयोग करने से पहले पतला. वैकल्पिक रूप से, डीएनए मानक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल (Zijlstra एट अल., 2002) के किसी भी संख्या का उपयोग कर निकाला जा सकता है है.
- मानव डीएनए लड़की मानव Alu दृश्यों के लिए मात्रात्मक पीसीआर विशिष्ट का उपयोग ऊतकों में पाया जाता है. मात्रात्मक पीसीआर Alu विशिष्ट प्राइमरों उपयोग कर रहा है किट Exract-N-amp से SYBR हरी प्रवर्धन का उपयोग कर प्रदर्शन किया. पीसीआर किट एक 2x प्रतिक्रिया SYBR हरे, बफर, लवण dNTPS, Taq पोलीमरेज़ और जम्पस्टार्ट Taq एंटीबॉडी युक्त मिश्रण के साथ आता है. प्रतिक्रिया मिश्रण 15μl के अंतिम मात्रा में प्रत्येक प्राइमर के 0.4μM के साथ किया जाता है. के लिए सबसे निकाले डीएनए का उपयोग उदाहरणों पतला 01:50 मात्रात्मक डेटा प्रदान करेगा, लेकिन, टेम्पलेट डीएनए के इष्टतम राशि empirically अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है. चिकन GAPDH प्राइमरों पीसीआर Alu दृश्यों के लिए निम्न स्थितियों के तहत चलाया जाता है एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं: 95 पर पोलीमरेज़ सक्रियण ° 2 95 30 चक्र द्वारा पीछा किया मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस के लिए सी एस 30, 63 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 एस , 72 ° सी एस 30 के लिए स्थितियों की प्रतिक्रिया के लिए चिकन GAPDH Alu के लिए वर्णित उन लोगों के लिए समान है लेकिन यह 40 चक्र को पीसीआर विस्तार के लिए आवश्यक हो सकता है.
- मेटास्टेसिस के मात्रात्मक विश्लेषण ΔΔCt एक नियंत्रण समूह (Schmittgen और Livak, 2008 के लिए प्रयोगात्मक समूहों की तुलना में विधि का उपयोग किया जाता है; Zijlstra एट अल, 2.) 002. वैकल्पिक रूप से एक मानक वक्र मानव ट्यूमर कोशिकाओं के कमजोर पड़ने श्रृंखला निकालें-N-amp किट (Zijlstra एट अल., 2002) का उपयोग कर निकाला उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है. सांख्यिकीय महत्व टी परीक्षण छात्र या नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के Anova विश्लेषण का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन किया जाता है.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. चिकन भ्रूण मेटास्टेसिस मॉडल. ए) एक चार पैनल पार अनुभाग में मॉडल के प्रमुख चरणों में उपस्थिति illustrating आरेख: 1. ऊष्मायन के 10 दिनों के के बाद. सीएएम के पास अधिकतम आकार तक पहुँच गया है. धमनियों और नसों Allantoic खिलाफ अंडे के ऊपर तैनात नस के साथ साफ़ दिखाई दे रहे हैं. 2. eggshell में दो छेद ड्रिलिंग के तुरंत बाद अंडा: airsac में और एक allantoic नस के लिए अनुलग्नक बिंदु करने के लिए आसन्न. 3. एक हल्के वैक्यूम के बाद उपस्थिति airsac खाली और सीएएम ड्रॉप करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ट्यूमर कोशिकाओं (नीला) गिरा सीएएम को लागू कर रहे हैं. 4. Grafted ट्यूमर कोशिका विकसित करने की अनुमति के बाद, चिकन भ्रूण से ऊतकों के साथ ट्यूमर के विश्लेषण के लिए harvested रहे हैं बी) मॉडल के एक धारावाहिक चित्रण: 1. . अंडे, incubating. 2. चिह्नित allantoic शिरा का स्थान है. 3. Eggshell में छेद ड्रिलिंग. 4. सीएएम गिराने, 5.. ट्यूमर सेल कलम बांधने का काम है. 6 के लिए एक खोलने काटना. ट्यूमर कोशिकाओं को लागू. 7. बर्फ पर अंडे शीतलक पहले ऊतक इकट्ठा करने के लिए. 8. विकास के 7 दिनों के बाद फसल काटने वाले ट्यूमर.
चित्रा 2 सीएएम ट्यूमर के प्रोटोकॉल. ट्यूमर असर chorioallantoic झिल्ली से लिया ऊतकों में formalin, sectioned तय किया गया था और एक trichrome दाग के साथ कार्रवाई की जाती है. ए) सांचा पर विकास के सात दिनों के बाद HEp3 ट्यूमर. बी और सी के एक दिखाने के लिए दोनों ट्यूमर और stroma से बढ़ाया क्षेत्रों दिखा. डी) normals सीएएम.
चित्रा 3. मेटास्टेसिस के मात्रात्मक अनुदैर्ध्य विश्लेषण. सिर के लिए और अधिक या कम metastatic क्षमता (HEp3 एम (उच्च) और HEp3 एम (कम) क्रमशः) के साथ गर्दन कार्सिनोमा HEp3 वेरिएंट उनके Alu पीसीआर का उपयोग प्रसार करने की क्षमता के लिए विश्लेषण किया गया. दस पशुओं को 7 दिनों की अवधि के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर विश्लेषण किया गया. इन नमूनों को एक मानक वक्र के खिलाफ मात्रा निर्धारित किए गए थे और बाद # ऊतक cells/50mg के रूप में व्यक्त की.
चित्रा 4. पशुओं में सहज मेटास्टेसिस कोशिकाओं के निषेध मेटास्टेसिस बाधा एंटीबॉडी 1A5 के साथ इलाज किया . 5x10 HEp3 5 दिन 10 भ्रूण का सांचा पर लागू कोशिकाओं का उपयोग ट्यूमर का गठन किया गया. ट्यूमर कोशिकाओं आधा जानवरों विरोधी CD151 1A5 एंटीबॉडी के साथ इलाज किया गया लगाने के बाद तीन दिनों के. ट्यूमर असर जानवरों से फेफड़ों के दो दिन बाद काटा गया और मात्रात्मक वास्तविक समय alu पीसीआर के अधीन है. विपरीत मात्रात्मक chGAPDH के वास्तविक समय पीसीआर मेजबान जीनोमिक डीएनए (ΔΔCt विधि के दो समूहों मात्रात्मक तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (बी) के बराबर मात्रा की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
चित्रा 5. Metastatic झरना में गिरफ्तारी, विकास, और intravasation मूल्यांकन. विकास की गिरफ्तारी की दर, और intravasation की दर: मूलरूप में, एक माध्यमिक अंग मेटास्टेसिस तीन पहलुओं के योगदान के द्वारा परिभाषित किया गया है. इन प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस (ए) और सहज मेटास्टेसिस (बी) का एक संयोजन का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है. गिरफ्तारी सेल की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस (ए) का प्रयोग 2hr पोस्ट इंजेक्शन का पता चला. जीवन रक्षा और गिरफ्तार कोशिकाओं के विकास सेल नंबर 24 घंटे के बाद इंजेक्शन में परिवर्तन के रूप में निर्धारित किया जाता है. ग्रोथ 3-7 दिनों के दौरान प्रसार की दर के रूप में परिभाषित किया गया है. Intravasation सहज मेटास्टेसिस (बी) जहां संख्या intravasated कोशिकाओं 7 दिन metastatic बोझ मौजूद है कि अधिक मूल्य metastatic 6 दिन पर मौजूद बोझ के विकास द्वारा भविष्यवाणी के रूप में परिभाषित किया गया है का उपयोग करने के लिए निर्धारित किया जाता है.
चित्रा 6. सीएएम में metastatic के Visualizing विस्तार. HEp3 GFP व्यक्त कोशिकाओं नसों के द्वारा विकासात्मक दिन 12 पर अंतःक्षिप्त थे. 1 दिन, 3, और 5 में एक अंडा था और बलिदान सीएएम के एक खंड के एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप के साथ imaged किया गया था. गहरे हरे रंग की पृष्ठभूमि eggshell के द्वारा बनाई गई है, vasculature काले लाइनों के रूप में दिखाई है, और ट्यूमर कोशिकाओं चमकीले हरे धब्बे के रूप में दिखाई दे रहे हैं.
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Discussion
लड़की सीएएम कैंसर जीव विज्ञान और metastatic प्रगति के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है. Metastatic क्षमताओं के सिद्धांत मूल्यांकन निद्रा का विश्लेषण सहित समूहों की एक किस्म के द्वारा किया गया है इस मॉडल में प्रदर्शन (एगुएर Ghiso एट अल, 1999; Ossowski और रैह, 1983), ऊतक (Deryugina एट अल, remodeling 2005;. हैन Dantona एट अल) 1999, (मेटास्टेसिस Zijlstra एट अल, 2008; Zijlstra एट अल, 2002).. यह प्रयोग के अपने आसानी, इसके लिए xenografts को स्वीकार करने की क्षमता की वजह से एक कैंसर जीव विज्ञान के लिए बहुत आकर्षक मॉडल जारी है, और अपनी कम लागत (चेम्बर्स एट अल, 1982, चेम्बर्स एट अल, 1990 ). मानव विशिष्ट Alu-आधारित मात्रात्मक पीसीआर (. किम एट अल, 1998; Zijlstra एट अल, 2002) का उपयोग हम मानव cpidermoid कार्सिनोमा सेल लाइन HEp3 (चित्रा 3) के metastatic प्रसार का विश्लेषण करने की क्षमता प्रदर्शित करता है. इसके अलावा हम चिकित्सकीय निषेध के मूल्यांकन में इस तकनीक की उपयोगिता का प्रदर्शन मेटास्टेसिस निरोधात्मक एंटीबॉडी 1A5 (4 आंकड़ा, (कचकड़ा एट अल, 1999; Zijlstra एट अल, 2008).) का उपयोग.
Metastatic क्षमता और उपचार की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम होने के अलावा, इस मॉडल को भी करने के लिए मात्रात्मक metastatic झरना (Zijlstra एट अल., 2002) के व्यक्तिगत घटकों का अध्ययन किया जा सकता है. ट्यूमर कोशिकाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस का उपयोग, इस मॉडल के कैंसर माध्यमिक अंगों में सेल की गिरफ्तारी और उनके बाद विकास (आंकड़ा 5A) के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. विकास की यह दर एक अनुदैर्ध्य सहज मेटास्टेसिस परख में metastatic बोझ (आंकड़ा 5B) की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Intravasation सहज मेटास्टेसिस (बी) जहां संख्या intravasated कोशिकाओं 7 दिन metastatic बोझ वर्तमान ऋण 6 दिन metastatic बोझ वर्तमान के विकास की भविष्यवाणी के द्वारा मान के रूप में परिभाषित किया गया है का उपयोग करने के लिए निर्धारित किया जाता है.
तकनीक का एक विस्तार के रूप में यहाँ की सूचना दी, हम हाल ही में उपन्यास रणनीति विकसित करने के लिए vivo में ट्यूमर सेल व्यवहार (Zijlstra एट अल, 2008), जो fluorescently लेबल नैनोकणों का उपयोग करने के लिए ट्यूमर microenvironment (Leong एट अल, 2010 लक्ष्य कल्पना, लुईस एट अल, 2006). इन तरीकों के माध्यम से अग्रिम, इस मॉडल की उपयोगिता के लिए जटिल और गतिशील परिवर्तन है कि अस्तित्व स्थापना, और ट्यूमर कोशिकाओं के विकास का समर्थन कल्पना शोषण किया जा सकता है. इन प्रौद्योगिकियों, अपेक्षाकृत कम लागत, immunodeficient प्रकृति, उपयोग में आसानी, और लड़की सीएएम की अनुकूलनशीलता के साथ मिलकर इस मॉडल इमेजिंग और कैंसर मेटास्टेसिस के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मूल्यवान बना.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उदारता से निषेचित अंडे प्रदान करने के लिए टायसन फूड्स इंक पहचान करना चाहते हैं. Shanna अर्नोल्ड इस प्रोटोकॉल के फिल्मांकन के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी. Trenis पामर रुथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार (F31 राष्ट्रीय कैंसर संस्थान) के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. इस काम आंशिक रूप से CCSRI # 700537 JDL और NIH / NCI अनुदान # CA120711-01A1-Z CA120711-01A1 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
