Summary
Использование количественной ПЦР, мы показали, как устоявшихся куриных CAM модель может быть использована для количественного анализа метастазирование опухолевых клеток человека в отдаленные органы.
Abstract
В клетках метастазов рака распространения от первичной опухоли, вторгнуться в окружающие ткани, и распространился на отдаленные органы. Метастазы сложный процесс, который может включать в себя многие виды тканей, диапазон различных периодов времени, и часто происходят глубоко внутри органов, что затрудняет расследование и количественно. Кроме того, эффективность метастатического процесса находится под влиянием нескольких этапов метастатического каскада, что затрудняет оценку вклада отдельного аспекта поведения опухолевых клеток. Как следствие, метастазы анализах часто выполняются в экспериментах на животных, чтобы обеспечить реалистичный обязательно контекст, в котором для изучения метастазов. К сожалению, эти модели еще более осложняется их комплексного физиологии. Куриного эмбриона является уникальным в естественных условиях модель, которая позволяет преодолеть многие ограничения к изучению метастазы, из-за доступности chorioallantoic мембраны (CAM), хорошо васкуляризированной экстра-эмбриональные ткани, расположенной под яичной скорлупы, которая восприимчива к xenografting опухолевых клеток (рис. 1). Более того, поскольку куриного эмбриона естественно иммунодефицитом, CAM с готовностью поддерживает приживление нормальных и опухолевых тканей. Самое главное, птичий CAM успешно поддерживает большинство раковых клеток характеристики, включая рост, инвазию, ангиогенез, и реконструкция микроокружения. Это делает модель исключительно полезными для исследования путей, которые приводят к раку метастазов и предсказать ответ метастатического рака с новыми потенциальными терапии. Обнаружение распространены клеток видоспецифические Алу ПЦР позволяет количественно оценивать метастазы в органах, которые колонизировали всего лишь 25 клеток. Использование прав Эпидермоидная клеточной линии карциномы (HEp3) мы используем эту модель для анализа спонтанного метастазирования раковых клеток в отдаленные органы, включая печень цыпленка и легких. Кроме того, использование Alu-PCR протокола мы демонстрируем чувствительность и воспроизводимость анализа в качестве инструмента для анализа и количественного intravasation, арест, кровоизлияние, и колонизации в качестве отдельных элементов метастазов.
Protocol
1. Подготовка яйца xenografting (спонтанное метастазирование)
- Только что заложен оплодотворенных куриных яиц инкубируют во вращающейся инкубаторе в течение 10 дней при температуре 100 ° С и влажности 60%. Яйца вращаются четыре раза в час.
- На 10-й день развития яйца находятся на их стороне в яйце стойку. Гусиная шея лампу или другой подходящий источник света используется для свечи яйца сияющий свет в яичной скорлупы на тупой конец яйца, где airsac находится.
- Chorioallantoic вены расположены и обозначены. Это вены находится в верхней части скорлупы, где она стыке нескольких крупных кровеносных сосудов. На этой точке ветвления кровеносных сосудов падает вниз, подальше от CAM и прикрепляется к эмбриону. 1см квадратный ящик обращается с карандашом на яичной скорлупы примерно 1 см от точки ветвления в вену. Области, включая и вокруг площади, затем очистить с помощью ватного тампона, пропитанной йодом.
- Использование вращающегося режущего инструмента (Dremel), снабженные карбида кремния шлифовального камня (Dremel часть # 84922) отверстие сверлится через тупой конец яйца в воздухе мешка. С помощью этого же инструмента отверстие пробуренной в пределах ранее нарисованных квадратных сверху яйцом, останавливаясь перед яичной скорлупы мембраны. 25-калибровочного шприца с тонкой бора на конце используется, чтобы сделать маленькое отверстие в скорлупе мембраны стараясь не порвать основной CAM. CAM в дальнейшем отделяется от скорлупы мембраны в области квадрат, используя нежное всасывание, созданные с помощью автоматической пипетки оснащена ¼ часть "трубы Tygon помещен против отверстие в airsac. При применении всасывания, воздушный карман должны под отверстием в квадрат, означающий, что CAM успешно упал от яичной скорлупы. После CAM упал, отверстие в воздухе мешка и отверстие, расположенное на площади у chorioallantoic вены уплотнен кусок ленты ленту лаборатории. Яйца затем помещаются в инкубатор стационарных при 100 ° С и влажности 60% в ожидании пересадки клеток опухоли. См. рисунок 1 для последовательного изображения.
2. Подготовка яиц для внутривенного введения (экспериментальные метастазы)
- Только что заложен оплодотворенных куриных яиц инкубируют во вращающейся инкубаторе в течение 12 дней при температуре 100 ° С и влажности 60%. Яйца вращаются четыре раза в час.
- На 12-й день развития яйца находятся на их стороне в яйце стойку. Гусиная шея лампу или другой подходящий источник света используется для свечи яйца сияющий свет в яичной скорлупы на тупой конец яйца, где airsac находится.
- Chorioallantoic вены расположены и обозначены. 1 см на 0,5 см прямоугольник с карандашом на яичной скорлупы непосредственно над веной. Области, включая и вокруг площади, затем очистить с помощью ватного тампона, пропитанной йодом.
- Небольшое окно создается в яичной скорлупы в нарисованной местоположение с помощью бит Dremmel сверла (# 118). Окно Обработке подвергается основной мембраны яичной скорлупы, который затем оказал прозрачный с каплю минерального масла. См. рисунок 5A для графического изображения.
- На данный момент дыру в воздухе мешка и отверстие, расположенное на площади у chorioallantoic вены уплотнен кусок ленты ленту лаборатории. Яйца затем помещаются в инкубатор стационарных при 100 ° С и влажности 60% в ожидании инъекционных опухолевых клеток.
3. Подготовка опухолевых клеток для трансплантации или инъекции.
- Для xenografting, опухолевые клетки отделяются от своей культуры от блюда с использованием трипсина / ЭДТА и промывают 10 томов фосфатным буферным раствором (PBS) для того, чтобы удалить остатки средства массовой информации, трипсина, или ЭДТА.
- Для внутривенного введения, культивируемые клетки отделяются использованием неферментативного клеточной диссоциации раствора и промывают бессывороточной DMEM. и)
- Клетки подсчитывают с hemacytometer и ресуспендировали в ФБР на 10-40 миллионов клеток / мл для прививки, или же ресуспендируют в бессывороточной DMEM на 1 млн. кл / мл для внутривенного введения.
4. Пересадка клеток опухоли на вновь подвергается CAM (Спонтанное метастазы)
- Яйца удаляются из инкубатора и небольшое окно обрезается по месту нахождения ранее нарисованных площади, где новые карманные воздуха сформировался. Проще всего это сделать с вращательный инструмент оснащен современной колесо (Dremel инструмент с # 409 круговой резки колесо). Пара иглы нос щипцов используется для удаления небольшой участок яичной скорлупы и показать основные CAM.
- Использование хлопка наконечником аппликатором (Fisher бренд № 23-400-001) CAM является прошлифовать 5 раз. Мало крови должно быть видно на хлопок. Сразу же после повреждения CAM, 25 мкл клеточной суспензии помещается на поврежденный участок. Оптимальное количество клеток определяется электроннойmpirically но может колебаться от 5 до 0.5X10 1x10 6. окна в яйцо запечатанном плотно лентой и птенцы остались стоять в течение 10-15 минут, чтобы дать клеткам, чтобы обосноваться. Через 15 минут яйца вернулся в стационарных инкубатора.
- Опухоли могут расти в течение 5-8 дней в зависимости от конкретного применения и характера опухоли клеточная линия используется. См. рисунок 1 для последовательного изображения.
5. Внутривенное введение опухолевых клеток (Экспериментальное метастазы)
- Использование 30 калибровочных инсулиновый шприц 100 мкл клеточной суспензии вводится в вену аллантоисную каждого эмбриона, яйца были возвращены в стационарных инкубатора и оставался там в течение дополнительных 1-7 дней.
- В различных точках времени, легких или ниже CAM собирают из каждого эмбриона и обрабатываются для выявления опухолевых клеток, как описано ниже.
6. Сбор опухолей и тканей куриных
- Рассечение область готова. Анализ обнаруживает метастатических клеток путем количественной оценки человеческого ДНК с помощью высокочувствительной ПЦР подход. Поэтому очень важно для предотвращения загрязнения с экзогенными ДНК. Вскрытия проводятся в выделенной области и по всей вскрытия инструменты очищаются после каждого животного. Для того, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение ваши образцы всей вскрытия процесса 3 отдельные наборы инструментов используются: один комплект для резки яйцо, один набор для удаления первичной опухоли и один набор для удаления внутренних органов. Кроме того, четыре контейнера мытья используются для последовательной промывки инструментов между собой животных. В последовательности этих моет являются: 1) двойное дистиллированной воды, 2) бидистиллированной воды, 3) хлорного отбеливателя и 4) 70% этанола.
- Яйца удаляются из стационарного инкубатора и помещен на льду в течение 15 минут, чтобы обезболить и эвтаназии животных. Окна открыты, что опухоли становятся видимыми. Открытие окна больше, удалив некоторые из яичной скорлупы может быть необходимым. Первичной опухоли резекции от CAM, взвешивали, и обрабатываемых в гистологии.
- Куриных удаляется из яичной скорлупы, сокращая оболочка радиально на равные половины. Эмбриона сливают из разреза оболочки и переданы в чистой стороне лодки груди взвесить. Животное расчлененный с использованием свежей, чистой набор инструментов. Животное открыл, проходящем через грудины. Как только эмбрион открыт, часть печени от правой или левой доли не собирается. Внутренние органы, которые затем удаляются осторожно потянув пищевода придает желудок и резки visera, которые подключаются органы. Для того, чтобы собирать легкие вырезать грудная клетка открыта грудь пластина отделяется и сердце удаляется. В этот момент можно обвести четыре стороны легких (верхняя ближе к голове с левой стороны вдоль грудной клетки, внизу возле диафрагмы и правой стороны вдоль трахеи). Для единообразия, то же самое легкое, собранных в каждого животного. Собранные образцы ткани хранятся при температуре -20 ° C для дальнейшего использования или могут быть обработаны сразу для выделения ДНК.
7. Геномная выделения ДНК и количественный анализ ПЦР
- Геномная ДНК, извлеченные из тканей с использованием SYBR экстракт зеленого-N-Amp тканей PCR Kit (Sigma-Aldrich Catalog # XNATRG). Извлеченный ДНК может быть переведен в чистую пробирку Эппендорф и хранили при -20 ° С или использовать немедленно. Важно, чтобы разбавить ДНК 1:50 в нуклеазы свободной воды перед использованием ее в последующей реакции ПЦР. Кроме того, ДНК может быть извлечен с помощью любого количества стандартных экстракции ДНК протоколов (Zijlstra и соавт., 2002).
- ДНК человека обнаружен в куриных тканей с использованием количественных ПЦР для человека последовательностей Alu. Количественный ПЦР с использованием Alu-специфических праймеров осуществляется с использованием SYBR зеленый усиления от Exract-N-Amp комплект. Комплект ПЦР поставляется с 2x смесь реакции содержащих SYBR зеленый, буфер, соли дНТФ, Taq-полимеразы и антител Jumpstart Taq. Реакционную смесь состоит в конечном объеме 15μl, с 0.4μM каждого праймера. Для большинства случаев использования извлечения ДНК разбавленный 1:50 обеспечит количественные данные, однако, оптимальное количество матричной ДНК, возможно, должны быть оптимизированы эмпирически. Куриные GAPDH грунтовки используются в качестве внутреннего контроля ПЦР выполняется при следующих условиях для последовательностей Alu: полимеразная активации при 95 ° С в течение 2 мин, затем 30 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 63 ° С в течение 30 сек , 72 ° С в течение 30 сек Условия реакции для цыпленка GAPDH идентичны тем, которые описаны для Alu однако это может быть необходимым продлить ПЦР до 40 циклов.
- Количественный анализ метастазирования выполняется с помощью метода ΔΔCt сравнения экспериментальных групп в контрольной группе (Schmittgen и Livak, 2008;. Zijlstra и др., 2002). Кроме стандартной кривой можно сгенерировать с помощью разбавления серии опухолевых клеток человека извлекали с помощью Извлечение-N-Amp комплект (Zijlstra и соавт., 2002). Статистическая значимость оценивается с помощью студенческих Т-тест или ANOVA анализ контрольных и экспериментальных групп.
8. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Метастазы куриного эмбриона модели. А) четыре схеме панели иллюстрирующие внешний вид модели в поперечном сечении в ключевых шагов: 1. После 10 дней инкубации. CAM достигло почти максимального размера. Артерии и вены отчетливо видны с аллантоисной вены расположены на верхней части яйца. 2. Яйца сразу после бурения двух отверстий в яичной скорлупы: один в airsac и один рядом с точки крепления для аллантоисной вены. 3. Появление после мягкого вакуум был использован для эвакуации airsac и падение CAM. Опухолевые клетки (синие) применяются к упала CAM. 4. После учета привитые опухоли расти, вместе с опухолью тканей куриного эмбриона собирают для анализа B) Серийный изображение модели. 1. Инкубация яиц., 2. Маркировка расположение аллантоисной вены., 3. Сверление отверстий в яичной скорлупе., 4. Удаление CAM., 5. Резка отверстие для опухолевых клеток прививки., 6. Применение опухолевых клеток., 7. Охлаждение яиц на льду до сбора ткани., 8. Сбор опухоли после 7 дней роста.
Рисунок 2. Гистология опухоли CAM. Тканей, взятых из опухолей подшипников chorioallantoic мембрану фиксировали в формалине, секционные и обработаны с trichrome пятно. ) HEp3 опухоли после семи дней роста на САМ. В и С показывают увеличенный регионов из показывая и опухоли и стромы. D) нормалей CAM.
Рисунок 3. Количественный анализ продольных метастазов. Варианты для головы и шеи HEp3 карциномы с высокой или низкой метастатической способности (HEp3 М (High) и HEp3 М (Low), соответственно) были проанализированы на предмет их способности распространять использованием Alu PCR. Десять животных были проанализированы в каждый момент времени в течение 7 дней. Эти образцы были количественно против стандартной кривой, а затем в виде # cells/50mg ткани.
Рисунок 4. Торможение спонтанной клетках метастазов у животных, получавших метастазы ингибирования 1A5 антител. Опухоли формируется с помощью 5x10 5 HEp3 клетки применяется к веб-камера день-10 эмбрионов. Через три дня после применения опухолевых клеток половина животных лечили анти-CD151 антител 1A5. Легкие от животных с опухолями были собраны два дня спустя и подвергаются количественной реальном времени алюминиевых ПЦР. Наоборот количественного ПЦР в реальном времени из chGAPDH был использован, чтобы подтвердить наличие эквивалентных количеств ДНК хозяина геномной (ΔΔCt метод был использован для сравнения две группы количественно (B).
Рисунок 5. Оценка арест, роста и intravasation в метастатического каскада. По сути, метастазы в вторичном органа определяется вклад трех аспектах: арест, темпы роста, и темпы intravasation. Они могут быть количественно, используя сочетание экспериментальных метастазов (А) и спонтанного метастазирования (B). Используя экспериментальные метастазы () ареста определяется как число клеточных обнаружены 2hr инъекции сообщение. Выживание и рост арестован клетки определяется как изменение числа клеток 24hr инъекции сообщение. Рост определяется как скорость распространения в течение дней 3-7. Intravasation определяется с помощью спонтанного метастазирования (B), где число intravasated клетки определяется как метастатические настоящим бременем на 7 день, что превышает значения, предсказанного роста метастатических бремя настоящее время на 6 день.
Рисунок 6. Визуализация расширение метастатическим в CAM. HEp3 клеток, экспрессирующих GFP вводили внутривенно на 12 день развития. На 1 день, 3 и 5 яичных был принесен в жертву и часть CAM был полученную с использованием флуоресцентного микроскопа стерео. Темном фоне зеленого создается яичная скорлупа, сосудистую видна как черные линии, а опухолевые клетки видны как ярко-зеленые пятна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Куриных CAM был использован для десятилетий в качестве модельной системы для изучения различных аспектов биологии рака и метастатической прогрессии. Принцип оценки метастатической способности были проведены в этой модели с помощью различных групп, включая анализ покоя (Агирре Ghiso и др., 1999;. Оссовский и Рейх, 1983), ткани ремоделирования (Дерюгина и др., 2005;. Хана-Dantona . и др., 1999), а метастазов (Zijlstra и др., 2008;. Zijlstra и др., 2002).. Он продолжает оставаться очень привлекательной моделью для биологии рака из-за своей простоты использования, его способность принимать ксенотрансплантаты, а его низкая стоимость (палат и др., 1982;. Палат и др., 1990.). Использование человеческих конкретных Алу основе количественной ПЦР (Ким и др., 1998;.. Zijlstra и др., 2002) мы демонстрируем способность анализировать метастатического распространения человека cpidermoid клеточной линии карциномы HEp3 (рис. 3). Кроме того, мы продемонстрировать полезность этого метода при оценке терапевтического использования торможение метастазирования тормозных 1A5 антител (рис. 4, (Теста и др., 1999;. Zijlstra и др., 2008).).
В дополнение к возможности оценки метастатической способности и ответа на лечение, эта модель также может быть использована для количественного исследования отдельных компонентов метастатического каскада (Zijlstra и соавт., 2002). Используя экспериментальные метастазы путем внутривенной инъекции опухолевых клеток, эта модель позволяет проводить анализ раковых клеток арест на вторичном органов и их последующий рост (рис. 5А). Это темпы роста могут быть использованы для предсказания метастатического нагрузка в продольном спонтанного анализа метастазы (рис. 5B). Intravasation определяется с помощью спонтанного метастазирования (B), где число intravasated клетки определяется как метастатические настоящим бременем на 7 день минус значения, предсказанного роста метастатических настоящим бременем на 6 день.
В качестве расширения методов сообщили здесь, мы недавно разработали новые стратегии для визуализации опухоли поведение клеток в естественных условиях (Zijlstra и др., 2008.), Которые используют флуоресцентно меченых наночастиц целевой опухоль микроокружения (Леонг и др., 2010;. Льюис и др. др.., 2006). С помощью этих методов продвижения, полезность этой модели могут быть использованы для визуализации сложных и динамичных изменений, которые поддерживают выживание, создание и рост опухолевых клеток. Эти технологии, в сочетании с относительно низкой стоимости, иммунодефицитных природе, простоты использования, и адаптивности куриных CAM делают эту модель ценной для работы с изображениями и количественный анализ рака метастазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотим, чтобы признать, Tyson Foods Инк щедро предоставления оплодотворенных яиц. Шанна Арнольд сыграл важную роль во время съемок этого протокола. Trenis Палмер была поддержана Национальным институтом здоровья под Рут Л. Kirschstein Национальный исследовательский Service Award (F31 National Cancer Institute). Эта работа была частично поддержана CCSRI Грант № 700537 на ЛЗЕ и NIH / NCI грант № CA120711-01A1 и 01A1-CA120711 на AZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
