Summary
El uso de PCR cuantitativa, se demuestra cómo la bien establecida chica modelo CAM se puede utilizar para analizar cuantitativamente la metástasis de células tumorales humanas a órganos distantes.
Abstract
En las células de la metástasis del cáncer de difundir el tumor primario, invaden los tejidos circundantes, y se extendió a órganos distantes. La metástasis es un proceso complejo que puede involucrar a muchos tipos de tejido, los períodos de duración variable de tiempo, y con frecuencia se producen en lo profundo de los órganos, por lo que es difícil de investigar y cuantificar. Además, la eficacia del proceso de metástasis está influido por diversas etapas de la cascada metastásica lo que hace difícil evaluar la contribución de un solo aspecto de la conducta de las células tumorales. Como consecuencia de ello, los ensayos de metástasis se realiza con frecuencia en animales de experimentación para proporcionar un contexto necesariamente realista en el que para estudiar la metástasis. Desafortunadamente, estos modelos se complica aún más por su compleja fisiología. El embrión de pollo es un único modelo in vivo que supera muchas limitaciones para el estudio de la metástasis, debido a la accesibilidad de la membrana corioalantoidea (CAM), un bien vascularizado extra-embrionarios de tejido situado debajo de la cáscara del huevo que es receptivo a los xenoinjertos de células tumorales (figura 1). Por otra parte, desde el embrión de pollo es, naturalmente, inmunodeficientes, la CAM fácilmente compatible con el injerto de tejidos normales y tumorales. Lo más importante, la CAM aviar apoya exitosamente la mayoría de características de las células del cáncer, incluido el crecimiento, la invasión, la angiogénesis y la remodelación del microambiente. Esto hace que el modelo excepcional para la investigación de las vías que conducen a la metástasis del cáncer y para predecir la respuesta del cáncer metastásico de nuevas terapias potenciales. La detección de células diseminadas por especies específicas PCR Alu hace posible evaluar cuantitativamente la metástasis en órganos que son colonizados por tan sólo 25 células. Utilizando la línea Humanos epidermoide carcinoma de células (HEp3) que utilizan este modelo para analizar la metástasis espontánea de las células del cáncer a órganos distantes, como el hígado de pollo y de pulmón. Además, utilizando el protocolo de Alu-PCR se demuestra la sensibilidad y reproducibilidad de la prueba como una herramienta para analizar y cuantificar intravasation, el arresto, la extravasación y la colonización como elementos individuales de la metástasis.
Protocol
1. La preparación de los huevos de xenoinjerto (metástasis espontánea)
- Recién puestos los huevos fertilizados de pollo se incuban en una incubadora de rotación de 10 días a 100 ° F y 60% de humedad. Los huevos se giran cuatro veces cada hora.
- El día 10 en el desarrollo de los huevos se colocan a su lado en un bastidor de huevo. Una fuente de la lámpara cuello de ganso o de otro tipo de luz adecuada se utiliza para las velas de los huevos por el resplandor de la luz en la cáscara del huevo en el extremo romo del huevo donde se encuentra la sacos aéreos.
- La vena corioalantoidea es ubicar y marcar. Esta vena se localiza en la parte superior de la cáscara del huevo donde se encuentra el cruce de varios grandes vasos sanguíneos. En este punto de ramificación de los vasos sanguíneos se despliega, lejos de la CAM y se une al embrión. Una caja cuadrada de 1 cm se dibuja con un lápiz en la cáscara del huevo de aproximadamente 1 cm de distancia desde el punto de ramificación de la vena. La zona, incluyendo alrededor de la plaza y se limpia con un algodón empapado en yodo.
- Usando una herramienta de corte rotativo (Dremel) equipado con una piedra de carburo de silicio de molienda (parte Dremel # 84922) se perfora un agujero a través del extremo romo del huevo en la cámara de aire. El uso de este mismo instrumento se taladra un agujero en la plaza previamente dibujado en la parte superior del huevo, sin llegar a la membrana de la cáscara del huevo. Una aguja de la jeringa de calibre 25 con una fresa fina en la punta se utiliza para hacer un pequeño agujero en la membrana de la cáscara de huevo con cuidado de no romper el subyacente CAM. La CAM es posteriormente separado de la membrana de la cáscara del huevo en el área de la plaza con una suave succión creada con una pipeta automática de la ayuda provista de una pieza de ¼ "tubo Tygon colocado junto al agujero en la sacos aéreos. Al aplicar succión, una bolsa de aire debe debajo del agujero en la plaza que significa que la CAM se ha logrado caer fuera de la cáscara del huevo. Después de la CAM se ha caído, el agujero en el saco de aire y el agujero situado en la plaza cerca de la vena corioalantoidea se sella con un pedazo de cinta de la cinta de laboratorio. Los huevos se comercialicen posteriormente en una incubadora fija a 100 ° F y 60% de humedad en previsión de injerto de las células tumorales. Véase la figura 1 para una descripción secuencial.
2. La preparación de los huevos para la inyección intravenosa (metástasis experimental)
- Recién puestos los huevos fertilizados de pollo se incuban en una incubadora de rotación de 12 días a 100 ° F y 60% de humedad. Los huevos se giran cuatro veces cada hora.
- El día 12 en el desarrollo de los huevos se colocan a su lado en un bastidor de huevo. Una fuente de la lámpara cuello de ganso o de otro tipo de luz adecuada se utiliza para las velas de los huevos por el resplandor de la luz en la cáscara del huevo en el extremo romo del huevo donde se encuentra la sacos aéreos.
- La vena corioalantoidea es ubicar y marcar. Un rectángulo de 1 cm por 0,5 cm se dibuja con un lápiz en la cáscara de los huevos directamente sobre la vena. La zona, incluyendo alrededor de la plaza y se limpia con un algodón empapado en yodo.
- Una pequeña ventana se crea en la cáscara del huevo en el lugar se dibuja con la broca Dremmel (# 118). La ventana se quita para exponer la membrana de la cáscara del huevo subyacente, que posteriormente se hizo transparente con una gota de aceite mineral. Vea la figura 5A para una representación gráfica.
- En este punto, el agujero en el saco de aire y el agujero situado en la plaza cerca de la vena corioalantoidea se sella con un pedazo de cinta de la cinta de laboratorio. Los huevos se comercialicen posteriormente en una incubadora fija a 100 ° F y 60% de humedad a la espera de la inyección de las células tumorales.
3. Preparación de las células tumorales para el injerto o inyección.
- De xenoinjerto, las células tumorales se desprenden de los platos de su cultura a través de tripsina / EDTA y se lava con 10 volúmenes de tampón fosfato salino (PBS) para eliminar cualquier residuo de medios, la tripsina, o EDTA.
- Para la inyección IV, las células cultivadas son separadas utilizando la disociación enzimática celular solución, y se lavaron con DMEM libre de suero. y)
- Las células se contó con un hemocitómetro y se resuspendieron en PBS a 10-40 million células / ml para el injerto, o, alternativamente, se resuspendieron en DMEM libre de suero en 1 millón de células / ml para inyección IV.
4. Injerto de las células tumorales a la recién expuesta CAM (metástasis espontánea)
- Los huevos son retirados de la incubadora y una pequeña ventana se reduce a la ubicación de la plaza previamente dibujadas en la bolsa de aire nuevo se ha formado. Esto se hace más fácilmente con una herramienta rotativa equipada con un disco de corte (herramienta Dremel con el # 409 de la rueda de corte circular). Un par de pinzas de punta de aguja se utiliza para eliminar la pequeña sección de la cáscara del huevo y exponer la CAM subyacente.
- El uso de un aplicador de algodón (marca Fisher # 23-400-001) de la CAM es erosionada 5 veces. Un poco de sangre debe ser evidente en el algodón. Inmediatamente después de dañar la CAM, 25μl de la suspensión celular se coloca en la zona dañada. El número óptimo de las células es determinada empirically pero puede variar de 0.5x10 5 a 6 1X10. La ventana en el huevo es sellado herméticamente con cinta adhesiva y los pollos se deja reposar durante 10-15 minutos con el fin de permitir que las células se asienten. Después de 15 minutos los huevos se devuelven a la incubadora estacionaria.
- Los tumores pueden crecer durante 5-8 días, dependiendo de la aplicación específica y la naturaleza de la línea de células tumorales utilizan. Véase la figura 1 para una descripción secuencial.
5. La inyección intravenosa de las células tumorales (metástasis experimental)
- El uso de un calibre 30 100μl jeringa de insulina de la suspensión celular se inyecta en la vena alantoideo de cada embrión, los huevos fueron devueltos a una incubadora inmóvil y permaneció allí por un período adicional de 1-7 días.
- En momentos distintos, el pulmón o el menor CAM se recogen de cada embrión y tratados para la detección de células tumorales, como se describe a continuación.
6. Tumores de la cosecha y los tejidos de pollo
- Un área de disección se prepara. El ensayo detecta las células metastásicas mediante la cuantificación de ADN humano con un enfoque de PCR de alta sensibilidad. Por tanto, es muy importante para evitar la contaminación con ADN exógeno. Disecciones se realizan en un área específica y en las disecciones de las herramientas se limpian entre cada animal. Con el fin de evitar la contaminación cruzada de las muestras en todo el proceso de disección tres series distintas de herramientas se utilizan: uno para cortar los huevos, uno para la extracción del tumor primario y otro para la eliminación de los órganos internos. Además, cuatro contenedores de lavado se utilizan para la secuencia de enjuague de las herramientas entre cada animal. En la secuencia, estas soluciones son: 1) el agua doblemente destilada, 2) agua doblemente destilada, 3) de cloro, y 4) El 70% de etanol.
- Los óvulos son retirados de la incubadora estacionaria y se coloca en hielo durante 15 minutos para anestesiar y practicar la eutanasia a los animales. Las ventanas se abren de tal manera que los tumores se hacen visibles. Abrir las ventanas más grandes mediante la eliminación de algunas de la cáscara del huevo puede ser necesario. Los tumores primarios se resecan de la CAM, se pesaron y se procesaron para histología.
- La chica se retira de la cáscara de huevo mediante la reducción de la capa radialmente en dos mitades iguales. El embrión se decanta de la concha cortada y se transfiere a un lado del pecho limpio pesar bote. El animal se diseca con el uso de un conjunto fresco y limpio de herramientas. El animal se abre cortando a través del esternón. Una vez que el embrión está abierto, un trozo del hígado, ya sea en el lóbulo izquierdo o derecho se recoge. Los órganos internos son posteriormente eliminados por tirando suavemente del esófago adjunta a la molleja y el corte de la visera que se conectan los órganos. Con el fin de recoger los pulmones corte de la caja torácica se abre la placa de pecho se separa y se extrae el corazón. En este punto, es posible cortar alrededor de los cuatro lados de los pulmones (la parte superior más cercano a la cabeza del lado izquierdo a lo largo de la caja torácica, la parte inferior cerca del diafragma y la parte derecha a lo largo de la tráquea). En aras de la coherencia, el mismo pulmón se recoge en cada animal. Cosecha muestras de tejido se almacenan a -20 ° C para su uso posterior o pueden ser procesados de inmediato para el aislamiento de ADN.
7. Aislamiento de ADN genómico y análisis de PCR cuantitativa
- ADN genómico se extrae de los tejidos utilizando el SYBR Green Extract-N-Amp PCR tejido Kit (Sigma-Aldrich Catálogo # XNATRG). El ADN extraído se pueden transferir a un tubo eppendorf limpio y se almacenan a -20 ° C o utilizarse de inmediato. Es importante para diluir el ADN 1:50 en agua libre de nucleasa antes de utilizarla en la posterior reacción de PCR. Por otra parte, el ADN puede ser extraído por medio de cualquier número de protocolos estándar de extracción de ADN (Zijlstra et al., 2002).
- El ADN humano se detecta en los tejidos de pollo con PCR cuantitativa específica para el consumo humano secuencias Alu. PCR cuantitativa utilizando Alu primers específicos se realiza mediante la amplificación verde SYBR del kit Exract-N-Amp. El kit de PCR viene con una mezcla de reacción que contiene 2x SYBR verde, buffer, dNTPs sales, Taq polimerasa y el anticuerpo Jumpstart Taq. La mezcla de reacción se compone en un volumen final de 15μl, con 0.4μM de cada cebador. Para la mayoría de los casos utilizando el ADN extraído diluido 1:50 proporcionará datos cuantitativos, sin embargo, la cantidad óptima de ADN puede ser necesario optimizar empíricamente. Pollo primers GAPDH se utilizó como control interno de la PCR se ejecuta bajo las siguientes condiciones para las secuencias Alu: activación de la polimerasa a 95 º C durante 2 min seguido por 30 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 63 ° C durante 30 s. , 72 ° C durante 30 s. Las condiciones de reacción para el pollo GAPDH son idénticos a los descritos para Alu sin embargo, puede ser necesario ampliar la PCR a 40 ciclos.
- El análisis cuantitativo de las metástasis se realiza utilizando el método ΔΔCt comparar los grupos experimentales con un grupo control (Schmittgen y Livak, 2008;. Zijlstra et al 2,002). Por otra parte una curva estándar se pueden generar mediante una serie de dilución de las células tumorales humanas extraídas con el kit de Extract-N-Amp (Zijlstra et al., 2002). La significación estadística se evaluó mediante prueba t de Student o el análisis de varianza de los grupos control y experimental.
8. Los resultados representativos:
Figura 1. El modelo de embrión de pollo metástasis. A) Un diagrama que ilustra el panel de cuatro aparición de la modelo en la sección transversal en los pasos clave: 1. Después de 10 días de incubación. La CAM ha alcanzado casi el tamaño máximo. Las arterias y las venas son claramente visibles con la vena alantoideo posicionado en contra de la parte superior del huevo. 2. El huevo inmediatamente después de perforar dos agujeros en la cáscara del huevo: una en el lado de sacos aéreos y el punto de unión de la vena alantoideo uno. 3. La aparición después de un leve vacío se ha utilizado para evacuar a los sacos aéreos y soltar la CAM. Las células tumorales (azul) se aplican a la CAM caído. 4. Después de permitir que el injerto de las células tumorales a crecer, el tumor, junto con los tejidos del embrión de pollo se cosechan para el análisis B) Una representación de serie del modelo. 1. La incubación de los huevos., 2. Marcar la ubicación de la vena alantoideo., 3. Taladrar agujeros en la cáscara del huevo., 4. Una caída del CAM., 5. Cortar una abertura para el injerto de las células tumorales., 6. La aplicación de las células tumorales., 7. De enfriamiento de los huevos en hielo antes de la recogida de tejidos., 8. La cosecha del tumor después de 7 días de crecimiento.
Figura 2. Histología de los tumores de la CAM. Tejidos tomados de la membrana corioalantoidea teniendo tumor se fijó en formalina, se cortaron y se procesaron con un tricrómico. A) HEp3 tumor después de siete días de crecimiento en la CAM. B y C muestran las regiones de una magnifica muestra tanto del tumor y el estroma. D) normales CAM.
Figura 3. El análisis cuantitativo longitudinal de la metástasis. Variantes de la cabeza y el cuello con carcinoma HEp3 la capacidad metastásica de alta o baja (HEp3 M (Alta) y HEp3 M (bajo), respectivamente) fueron analizados por su capacidad para difundir el uso Alu PCR. Diez animales fueron analizados en cada momento durante la duración de 7 días. Estas muestras se cuantificó con una curva estándar y expresó posteriormente como # cells/50mg tejido.
Figura 4. La inhibición de las células de metástasis espontánea en animales tratados con el anticuerpo 1A5 inhibir la metástasis. Los tumores se forman con 5x10 5 células HEp3 aplicada a la medicina complementaria y alternativa del día 10 embriones. Tres días después de la aplicación de las células tumorales la mitad de los animales fueron tratados con el anticuerpo anti-CD151 1A5. Los pulmones de los animales portadores de tumores se cosecharon dos días más tarde y se somete a la PCR cuantitativa en tiempo real de aluminio. Por el contrario cuantitativas PCR en tiempo real de chGAPDH se utilizó para confirmar la presencia de cantidades equivalentes de ADN genómico de acogida (El método ΔΔCt se utilizó para comparar los dos grupos cuantitativamente (B).
Figura 5. Evaluación de la detención, el crecimiento y intravasation en la cascada metastásica. Fundamentalmente, la metástasis de un órgano secundario se define por las contribuciones de los tres aspectos: paro, tasa de crecimiento, y la tasa de intravasation. Estos pueden ser cuantificados usando una combinación de metástasis experimental (A) y la metástasis espontánea (B). Usando la metástasis experimental (A) la detención se define como el número de celular detecta después de la inyección 2h. Supervivencia y el crecimiento de células detenidas se determina como el cambio en la inyección de células de puesto: 24 horas. El crecimiento se define como la tasa de proliferación durante los días 3-7. Intravasation se determina mediante la metástasis espontánea (B), donde las células del número intravasated se define como la carga de presentar metástasis en el día 7 que supera el valor predicho por el crecimiento de la carga metastásica presente en el día 6.
Figura 6. Visualizar la expansión de la metástasis en el CAM. HEp3 células que expresan GFP se inyecta por vía intravenosa en 12 días de desarrollo. El día 1, 3 y 5 un huevo fue sacrificado y una sección de la CAM fue fotografiada con un microscopio estereoscópico fluorescente. El fondo de color verde oscuro se crea por la cáscara del huevo, los vasos se puede ver como las líneas de negro, y las células tumorales se ven como brillantes manchas verdes.
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Discussion
El CAM de pollo se ha utilizado durante décadas como un sistema modelo para estudiar diversos aspectos de la biología del cáncer y la progresión metastásica. Evaluación de las habilidades principio metastásico se han realizado en este modelo por una variedad de grupos, incluyendo el análisis de latencia (Ghiso Aguirre et al, 1999;. Ossowski y Reich, 1983), la remodelación de tejidos (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999) y metástasis (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. Sigue siendo un modelo muy atractivo para la biología del cáncer, debido a su facilidad de uso, su capacidad de aceptar los xenoinjertos, y su bajo costo (Chambers et al, 1982;. Chambers et al, 1990).. El uso humano específico Alu-cuantitativo basado en la PCR (Kim et al, 1998;.. Zijlstra et al, 2002) que demuestran la capacidad de analizar la diseminación metastásica de la línea humana cpidermoid carcinoma de células HEp3 (Figura 3). Además de demostrar la utilidad de esta técnica en la evaluación de la inhibición de la terapéutica con el anticuerpo 1A5 metástasis inhibidor (figura 4, (Testa et al, 1999;. Zijlstra et al, 2008).).
Además de ser capaz de evaluar la capacidad de metástasis y la respuesta al tratamiento, este modelo también se puede utilizar para estudiar cuantitativamente los componentes individuales de la cascada metastásica (Zijlstra et al., 2002). Usando la metástasis experimental mediante inyección intravenosa de las células tumorales, este modelo permite el análisis de la detención de las células cancerosas en los órganos secundarios y su posterior crecimiento (Figura 5). Esta tasa de crecimiento puede ser utilizado para predecir la carga metastásica en un ensayo de metástasis espontánea longitudinal (Figura 5). Intravasation se determina mediante la metástasis espontánea (B), donde las células del número intravasated se define como la carga de presentar metástasis en el día 7, menos el valor pronosticado por el crecimiento de la carga de presentar metástasis en el día 6.
Como una extensión de las técnicas que aquí, hemos desarrollado recientemente nuevas estrategias para visualizar el comportamiento de las células tumorales in vivo (Zijlstra et al, 2008.), Que utilizan nanopartículas marcado con fluorescencia para apuntar el microambiente del tumor (Leong et al, 2010;. Lewis et al., 2006). A través de estos métodos de promoción, la utilidad de este modelo puede ser explotada para visualizar los cambios complejos y dinámicos que apoyan la supervivencia, establecimiento y crecimiento de las células tumorales. Estas tecnologías, junto con el costo relativamente bajo, la naturaleza inmunodeficientes, facilidad de uso y adaptabilidad de la CAM de pollo hacen de este modelo valioso para la imagen y el análisis cuantitativo de la metástasis del cáncer.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Queremos reconocer a Tyson Foods Inc. para ofrecer generosamente los huevos fertilizados. Shanna Arnold jugó un papel decisivo durante el rodaje de este protocolo. Trenis Palmer fue apoyada por los Institutos Nacionales de la Salud bajo el Premio Ruth L. Kirschstein Servicio Nacional de Investigación (F31 Instituto Nacional del Cáncer). Este trabajo fue parcialmente financiado por una beca # 700537 CCSRI a JDL y los NIH / NCI subvención # CA120711-01A1-01A1 y CA120711 a AZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher Scientific | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract—N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
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