Summary
Undersøgelsen beskriver en cost-effektiv metode til identifikation af kilden til fækal / urin forurening eller forurening med nitrater i vand ved hjælp qPCR for den specifikke kvantificering af human / svin / kvæg DNA virus, adenovirus og polyomaviruses, foreslået som MST værktøjer.
Abstract
Mikrobiel forurening af miljøet udgør en betydelig sundhedsrisiko. Klassisk bakteriel fecal indikatorer har vist sig at have væsentlige begrænsninger, vira er mere modstandsdygtige over for mange inaktivering processer og standard fækal indikatorer ikke informere om kilden til forureningen. Udvikling af omkostningseffektive metoder til koncentration af virus fra vand og molekylære assays letter anvendeligheden af vira som indikatorer for fækal forurening og som mikrobiel kildesporing (MST) værktøjer. Adenovirus og polyomaviruses er DNA-virus inficerer specifikke hvirveldyr arter, herunder mennesker og er vedvarende udskilles i afføring og / eller urin i alle geografiske undersøgte områder. I tidligere undersøgelser, foreslog vi kvantificering af menneskelige adenovirus (HAdV) og JC polyomaviruses (JCPyV) ved kvantitativ PCR (qPCR) som et indeks over menneskelig fækal forurening. For nylig har vi udviklet qPCR assays for den specifikke kvantificering af porCine adenovirus (PAdV) og bovin polyomaviruses (BPyV) som dyr fecal markører for forurening med følsomheder på 1-10 genom kopier pr reagensglas. I denne undersøgelse præsenterer vi den procedure, der skal følges for at identificere kilden til forurening i vandprøver ved hjælp af disse værktøjer. Som eksempel på repræsentative resultater, er en analyse af virus i grundvand præsentere højt indhold af nitrat vist.
Påvisning af virus i lav eller moderat forurenet vand kræver, at koncentrationen af virus fra mindst flere liter vand i en meget mindre volumen, en procedure, der normalt omfatter to koncentrering i serie. Denne noget besværlige procedure og variation hos viral inddrivelser betydeligt hæmmer samtidig behandling af et stort antal vandprøver.
For at fjerne den flaskehals er forårsaget af de to trin procedurer, vi har anvendt en et-trins protokol udviklet i tidligere studies og som gælder for en mangfoldighed af vand matricer. Proceduren omfatter: forsuring af ti-liters vandprøver, flokkulering af skummetmælk, tyngdekraften sedimentering af flocculated materialer, indsamling af bundfaldet og centrifugering, resuspension af bundfaldet i 10 ml fosfatbuffer. Den virale koncentrat bruges til udvinding af virale nukleinsyrer og de specifikke adenovirus og polyomaviruses af interesse er kvantificeret ved qPCR. Stort antal prøver kan samtidig analyseres ved denne billige koncentration metode.
Den procedure er blevet anvendt til analyse af badevand, havvand og flodvand, og i denne undersøgelse, præsenterer vi resultaterne analysere grundvand prøver. Denne high-throughput kvantitative metode er pålidelig, ligetil, og omkostningseffektiv.
Protocol
1. Koncentration af den virale partikler til stede i vandprøverne
- Indsamling og konditionering af vandprøver
- Saml mindst 2 replikater af 10 L pr prøve i plastbeholdere med flad bund og en ekstra prøve som en proces kontrol. Denne sidste prøve vil blive tilsat en kendt mængde af virale partikler og bruges som en kontrol.
Bemærk: Det anbefales at have specielle separate materiale (flasker, rør, osv.) for spikede prøver. - Tjek kalibrering af conductimeter og rekalibrere hvis det er nødvendigt. Forbered en negativ kontrol ved at bruge vand fra hanen tidligere justeret til en passende ledningsevne (se nedenfor 1.6) i en ekstra plast 10 L beholder.
- For spiked prøver: Tilsæt standard volumen kontrol virus (ca. 10 5 genom kopier pr 10 L vand) til prøven. Bland ved omrøring undgå sprøjt og aerosoler. Positive kontroller kunne bestå i en ualmindelig stamme af adenovirus ssn sådan som HAdV-35 eller en bakteriofag som MS2.
- Hvis prøven viser høje mængde af suspenderet materiale (sand eller andre materialer), lad det sediment i 15 minutter. Overfør vand i en ny container.
- Justér pH i vandprøven til 3,5 (± 0,1) ved tilsætning af 1 N HCl. Dette trin er vigtigt for koncentrationen af virus, så sørg for, at pH-værdien er justeret korrekt. Bland vand, grundigt ved kraftig omrøring samtidig med at tilføje de HCl. (Bemærk: Hvis pH-værdien er lavere end 3,5 ADD 1 M NaOH).
- Juster ledningsevne. Hvis prøven har en ledningsevne på 1500 mikrosiemens / cm eller højere, er dette trin ikke nødvendigt. Hvis ledningsevne er lavere end 1500 mikrosiemens / cm dannelsen af flocculated materiale (flokke) er ikke garanteret, så justere ledningsevne til 1500 mikrosiemens / cm ved tilsætning af kunstige sø salte (Sigma). Bland grundigt ved omrøring samtidig med at tilføje havet salte.
- Notér pH af prøverne før og efter konditionering samt ens mængden af HCl anvendes. Ledningsevnen bør også registreres efter justering af pH. Altid desinficere pH-meter og conductimeter elektroder med en frisk HCl-opløsning, dechlorinate med 10% natrium tiosulphate løsning og til sidst skylles med destilleret vand.
- Saml mindst 2 replikater af 10 L pr prøve i plastbeholdere med flad bund og en ekstra prøve som en proces kontrol. Denne sidste prøve vil blive tilsat en kendt mængde af virale partikler og bruges som en kontrol.
- Udarbejdelse af pre-flocculated 1% skummetmælk (PSM)
- Tjek kalibrering af pH-meter og conductimeter og rekalibrere hvis det er nødvendigt.
- Forbered pre-flocculated skummetmælk opløsning (1% PSM, w / v) ved at opløse 10 g skummetmælkspulver (Difco) i 1 L kunstigt havvand (opløses 33,3 g kunstig sø salte i 1 L af dechlorinated vand fra hanen og autoklaver) og omhyggeligt at justere pH til 3,5 med 1 N HCl. De flokke skal være synlig. Opløsningen tilberedes lige før der skal bruges eller opbevares ved 4 ° C i 24 h. For dechlorination bruger 1 ml 10% tiosulphate opløsning pr 100 ml vand.
- Flokkulering af virale partikler til stede i vandprøverne
- Tilsæt 100 ml 1% PSM til den 10-L vandprøve.
- Rør prøverne i 8-10 timer at lade vira at adsorbere til flokke. Brug en timer til slukning af omrøring efter 8-10 t.
- Stop omrøring og lad flokke sedimentet ved hjælp af tyngdekraften til 8-10 t.
- Indsamling og re-opløsning af flokke. Centrifugering
- Fjern supernatanten ved hjælp af en peristaltisk pumpe og en plastic pipette tilsluttet et plasticrør. For spiked prøver supernatanten skal indsamles i en flaske og desinficeres efter interne procedurer. I alle tilfælde sørge for ikke at indsamle de pellet.
- Saml sedimentet med flokke (ca. 500 ml) i en centrifuge flaske.
- Balance gryderne ved tilsætning af PSM pH 3,5.
- Centrifuger potter i en high-speed centrifuger ved 8.000 xg i 30 min ved 4 ° C. Så snart centrifugen stopper, fjern forsigtigt centrifugen potter fra centrifugen.
- Meget gstændigt hæld, og supernatanten. Følg passende foranstaltninger for smittefarligt materiale.
- Tilføj 7 ml fosfatbuffer at opløse pellet i hver centrifuge flaske.
- Når flokke er blevet opløst, måle og tilføje fosfatbuffer at nå et samlet volumen på 10 ml.
- Homogeniseres viral koncentrere sig ved hvirvelblanding og distribuere de 10 ml i rene mikrorør, der skal fryses ved -80 ° C indtil de skal bruges i den videre analyse.
2. Nukleinsyre udvinding
- Udfør en nukleinsyre ekstraktion med QIAamp Viral RNA Mini Kit følge producentens anvisninger. Dette sæt muliggør brugen af en automatiseret platform (såsom Qiacube, Qiagen).
3. Kvantitativ PCR menneskelige adenovirus (HAdV), JC polyomaviruses (JCPyV), svin adenovirus (PAdV) og bovin polyomaviruses (BPyV)
- Kvantificering af genom kopier i prøverne
- Forberedde qPCR mix i et rent separat område ved hjælp af TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). Reaktionen foregår i en 96-brønds optisk reaktion tallerken dækket med optisk lim dækker. Koncentrationerne af Master Mix, er primere og prober, der er beskrevet i tabel 1.
- Når blandingen er blevet udarbejdet, alikvot 15μl i hver brønd, herunder den kontrol (se 3.2). Den samlede mængde for en reaktion efter tilsætning af målet vil blive 25μl (15μl mix + 10μl prøve eller standard).
- Tilsæt nukleinsyre udtræk fra prøverne (10μl) i et separat område. Kør direkte og en ti-fold fortynding med renset vand af hver prøve i to eksemplarer. Dæk brønde, der indeholder prøver med en del af en selvklæbende dækning, beholde den anden del af dækning for de følgende trin.
- Tilsæt fortyndinger af DNA standard suspensioner (10μl) fra 10 0 til 10 6 GC/10μl ved tre eksemplarer og brug en mikropipette udelukkende anvendes til standard DNA. Det er tilrådeligt at tilføje standarder i et område udstyret med UV-stråling for at ødelægge plasmid DNA og at rense mikropipette efter hver brug. Dæk brønde indeholder de standarder, med pre-cut selvklæbende cover.
Bemærk: For at forberede standard suspensioner der skal bruges i kvantificering af genom kopier, bør mål-DNA regionen blive klonet i et plasmid og lineært. I det følgende adresse, du vil finde en detaljeret procedure for, hvordan man skaber standard kurver med plasmid DNA skabeloner til brug i qPCR:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - Udfør qPCR til et hensigtsmæssigt system at vælge de relevante parametre (overvejer brugen af lim dækning og det samlede volumen i hver brønd, osv.). Efter aktivering af AmpliTaq Gold i 10 min ved 95 ° C, 40 cyklusser af forstærkning udføres som følger: 15 s ved 95 ° Cog 1 min ved 60 ° C i HAdV, JCPyV og BPyV, og 15 s ved 95 ° C, 20'erne ved 55 ° C og 20'erne ved 60 ° C i PAdV.
- Når reaktionerne er afsluttet, lagre data og resultater som beskrevet i brugervejledningen til det anvendte udstyr. Mængden af DNA vil blive defineret som medianen af de data, der efter korrektion fortyndingsfaktoren når det er nødvendigt.
- Controls
- Brug positive og negative kontroller. Analysen skal indeholde mere end en ikke-skabelon kontrol (NTC) for at bevise blande ikke producerer fluorescens. Det er tilrådeligt at køre den positive proces kontrol for at vurdere potentielle enzymatisk hæmning på grund af hæmmere til stede i de undersøgte prøver.
- Optag resultaterne af qPCR analyser af to forskellige fortyndinger af standard DNA og fra processen kontrol. Brug resultaterne til at udarbejde kontrolkort for kvalitetskontrol (QC) programmer relateret til følsomhed og effektivitet assays.
- Bekræftelse afresultater
- Positive resultater kan blive yderligere bekræftet ved hjælp af indlejrede-PCR og nucleotidsekvensen af amplikationsprodukter, opdaget 1,5,6,7,9,12 producere yderligere data om den nukleotidsekvenserne af stammerne.
Efter beskrives proceduren, har menneskers og dyrs virus påvist og kvantificeret i badevand, havvand og flodvand 2,3. Som et repræsentativt eksempel, blev jorden vandprøver fra områder præsentere et højt niveau af nitrat vurderet til at definere kilderne til forureningen. Ti-liters vandprøver blev indsamlet fra 4 forskellige brønde i landdistrikterne af en nordøst region i Spanien. Fem replikater blev indsamlet i hver brønd være en replikere tilsået med menneskelige adenovirus 2 bruges som proces kontrol. Prøverne blev behandlet i henhold til protokollen er repræsenteret i figur 1. De fire replikater analyseret i en af de fire undersøgte lokaliteter viste positive resultater for PAdV (middelværdi 7,74x10 2 GC / L), som vil være relateret til tilstedeværelsen af svine-gylle i områderne omkring prøvetagningsstedet og ville støtte fækal svin forurening som kilde til nitrat i grundvand (tabel 2).
4. Repræsentative resultater:
Figur 1. Procedure for påvisning og kvantificering af virus i vand.
Tabel 1. Koncentration af primere og prober til qPCR assays.
Tabel 2. Påvisning og kvantificering af dyr og mennesker adenovirus og polyomaviruses i grundvand prøver.
n antal replikater analyserede
% Andel af positive replikater
(-) Ikke fundet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne procedure ville opfylde betingelserne for en passende metode til rutinemæssig miljø og folkesundhed laboratorier: reproducerbare, pålidelige, enkle og omkostningseffektive. Protokollen er simpel, men det skal følges nøje. Lav ledningsevne i prøverne uden at tilføje den ønskede koncentration af kunstigt havvand salte vil dramatisk reducere inddrivelse af vira som ville være tilfældet, hvis omrøring tid til flokkulering væsentligt reduceret (mindre end 5 timer for eksempel).
Aktuelt anvendte MST værktøjer er generelt baseret på molekylære teknikker. Undersøgelser er udviklet af forskellige grupper har vist, at ud af det aktuelt anvendte parametre (dvs. bakterielle gener) ingen er så specifik efter behov. Således brug af en kombination af disse parametre er blevet foreslået som den bedste approksimation for en effektiv sporing af oprindelsen af fækal forurening i vandområder 8,11.
jove_content "> I de senere år er studiet af de udvalgte DNA-virus, der producerer i mange tilfælde vedvarende infektioner i fravær af kliniske symptomer, dukket op som en metode til kilde-sporing af fækal forurening i miljøet. Kvantitativ PCR teknikker og koncentrationen foreslåede metode give pålidelige værdier af koncentrationen af disse virus og meget værdifulde data for udviklingen af risikovurdering undersøgelser og oprydning handlinger. Disse teknikker er også meget sensitiv og specifik, hvilket er en absolut forudsætning for at spore kilden til forureningen. Også, de vil være et meget nyttigt værktøj til generering af større databaser til kvantitativ karakterisering af udskillelsen og formidling af den specifikke virus foreslået som mikrobiel source-tracking værktøjer i forskellige geografiske områder.Den beskrevne procedure giver mulighed for analyse af flere prøver samtidigt i omkring 48 timer uden intensiv arbejdskraft kravS. Tilgængeligheden af en effektiv billig koncentration metoden støtte anvendeligheden af HAdV og JCPyV, og PAdV og BPyV i vand så omkostningseffektiv assays til kvantitativ mikrobiel source-sporing og identifikation af oprindelsen af forurenende stoffer i grundvandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
To patentansøgninger blev indgivet i 2009 for at beskytte den intellektuelle ejendomsret af protokoller til kvantificering af PAdV og BPyV.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af den spanske regering "Ministerio de Educación y Ciencia" (projekt AGL2008-05275-C01/ALI), af Den Europæiske Union forskningsrammeprogram 7 støttede projekter VIROBATHE (Kontrakt nr. 513648), VIROCLIME (Kontrakt nr. 243923 ) og af det catalanske agentur for Vand, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de Control I Millora Dels Ecosistemes Aquatics. I løbet af de udviklede studiet Marta Rusinol var en fyr i den catalanske regering "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
