Summary
अध्ययन मल / मूत्र या पानी में नाइट्रेट मानव / शूकरीय / गोजातीय डीएनए वायरस, एडिनोवायरस और polyomaviruses, MST उपकरण के रूप में प्रस्तावित की विशिष्ट मात्रा का ठहराव के लिए qPCR का उपयोग करके संदूषण संदूषण के स्रोत की पहचान के लिए एक लागत प्रभावी विधि का वर्णन करता है.
Protocol
1. वायरल कणों की एकाग्रता पानी के नमूनों में मौजूद
- संग्रह और पानी के नमूनों की कंडीशनिंग
- लीजिए फ्लैट और एक प्रक्रिया नियंत्रण के रूप में एक अतिरिक्त नमूना नीचे के साथ प्लास्टिक के कंटेनर में 2 की एक न्यूनतम नमूना प्रति 10 एल के replicates. यह आखिरी नमूना वायरल कणों का एक ज्ञात मात्रा के साथ नुकीला हो जाएगा और एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया.
नोट: यह नुकीला नमूने के लिए विशेष अलग सामग्री (बोतलें, ट्यूब, आदि) की सिफारिश की है. - Conductimeter के अंशांकन की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो recalibrate. एक अतिरिक्त प्लास्टिक एल 10 कंटेनर में नल पहले पर्याप्त चालकता के लिए समायोजित पानी (1.6 नीचे देखें) का उपयोग करके एक नकारात्मक नियंत्रण की तैयारी.
- बालीदार नमूने के लिए: नमूना नियंत्रण वायरस की मानक मात्रा (लगभग 10 पानी की 10 एल प्रति 5 प्रतियां जीनोम) जोड़ें. Splashing और एयरोसौल्ज़ परहेज सरगर्मी से मिलाएं. सकारात्मक नियंत्रण adenovirus एस के एक असामान्य तनाव में मिलकर सकता हैHAdV-35 या एक जीवाणुभोजी MS2 रूप में के रूप में uch.
- यदि नमूना प्रस्तुत निलंबित सामग्री (रेत या अन्य सामग्री) की उच्च मात्रा, यह तलछट 15 मिनट के लिए. एक नई कंटेनर में पानी स्थानांतरण.
- पानी के नमूने के पीएच 3.5 (± 0.1) एन 1 एचसीएल के अलावा द्वारा समायोजित करें. वायरस की एकाग्रता के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है, तो सुनिश्चित करें पीएच ठीक से समायोजित किया गया है. पानी अच्छी तरह से जोरदार आलोड़न द्वारा जबकि एचसीएल जोड़ने मिक्स. (नोट: यदि पीएच 3.5 जोड़ने के 1 एम NaOH से कम है).
- चालकता समायोजित. यदि नमूना 1500 μS / सेमी या अधिक की एक चालकता है, इस कदम की जरूरत नहीं है. यदि चालकता 1500 μS / सेमी flocculated सामग्री का गठन (flocs) की गारंटी नहीं है की तुलना में कम है तो कृत्रिम समुद्र लवण (सिग्मा) के अलावा द्वारा 1500 μS / सेमी चालकता समायोजित. भावप्रवण जबकि समुद्र लवण जोड़ने द्वारा सख्ती मिक्स.
- पहले और कंडीशनिंग के बाद के रूप में एक अच्छी तरह से नमूनों का पीएच रिकॉर्डएचसीएल की मात्रा का इस्तेमाल किया. चालकता भी पीएच को समायोजित करने के बाद दर्ज किया जाना चाहिए. हमेशा एक ताजा एचसीएल समाधान के साथ पीएच मीटर और conductimeter इलेक्ट्रोड कीटाणुरहित करने के लिए, 10% सोडियम tiosulphate समाधान के साथ dechlorinate और अंत में आसुत पानी से कुल्ला.
- लीजिए फ्लैट और एक प्रक्रिया नियंत्रण के रूप में एक अतिरिक्त नमूना नीचे के साथ प्लास्टिक के कंटेनर में 2 की एक न्यूनतम नमूना प्रति 10 एल के replicates. यह आखिरी नमूना वायरल कणों का एक ज्ञात मात्रा के साथ नुकीला हो जाएगा और एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया.
- पूर्व flocculated 1% स्किम्ड दूध की तैयारी (PSM)
- PH मीटर और conductimeter के अंशांकन की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो recalibrate.
- 1 एल कृत्रिम समुद्री जल में 10 ग्राम स्किम्ड दूध पाउडर (Difco) भंग करके पूर्व flocculated स्किम्ड दूध समाधान (1% PSM, w / वी) तैयार है (1 dechlorinated नल का पानी और आटोक्लेव के एल में कृत्रिम समुद्र लवण की 33.3 छ भंग) और सावधानी 1N एचसीएल के साथ 3.5 पीएच समायोजन. flocs दिखाई जानी चाहिए. 24 एच. के लिए समाधान बस से पहले इस्तेमाल किया जा करने के लिए या 4 बजे दुकान ° सी की तैयारी Dechlorination के लिए 10% पानी की 100 मिलीलीटर प्रति tiosulphate समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें.
- वायरल कणों की flocculation पानी के नमूनों में मौजूद
- 10 एल पानी नमूने के 1% के पी एस एम के 100 मिलीलीटर जोड़ें.
- 8-10 घंटे के लिए नमूने हिलाओ वायरस flocs सोखना करने के लिए अनुमति देते हैं. करने के लिए स्विच बंद सरगर्मी एच. 8-10 के बाद एक टाइमर का प्रयोग करें
- सरगर्मी बंद करो और 8-10 एच. के लिए गंभीरता से flocs तलछट चलो
- इकट्ठा करने और फिर से भंग flocs. Centrifugation
- एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और एक प्लास्टिक की एक प्लास्टिक की ट्यूब से जुड़ा पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला निकालें. नमूने के लिए नुकीला सतह पर तैरनेवाला एक बोतल में एकत्र किया जाना चाहिए और आंतरिक प्रक्रियाओं के लिए अनुसार विसंक्रमित. गोली एकत्रित नहीं सभी मामलों में ख्याल रखना.
- एक अपकेंद्रित्र बोतल में flocs (लगभग 500 मिलीलीटर) के साथ तलछट लीजिए.
- PSM 3.5 पीएच के अलावा द्वारा बर्तन बैलेंस.
- 4 में 30 मिनट के लिए 8000 XG में एक उच्च गति अपकेंद्रित्र में बर्तन अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस जैसे ही अपकेंद्रित्र बंद हो जाता है है, ध्यान अपकेंद्रित्र से अपकेंद्रित्र बर्तन हटाने.
- बहुत जीently ढलकना और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. संक्रामक सामग्री के लिए उचित उपायों का पालन करें.
- प्रत्येक अपकेंद्रित्र बोतल में गोली भंग फॉस्फेट बफर के 7 मिलीलीटर जोड़ें.
- एक बार flocs भंग किया गया है, को मापने, और 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा तक पहुँचने के लिए फॉस्फेट बफर जोड़ने के लिए.
- Vortexing द्वारा वायरल ध्यान केंद्रित homogenize और साफ microtubes जो -80 में जमे हुए किया जाना चाहिए में 10 मिलीलीटर वितरित डिग्री सेल्सियस आगे के विश्लेषण में जरूरत है जब तक.
2. न्यूक्लिक अम्ल निकासी
- QIAamp वायरल शाही सेना मिनी निर्माता के निर्देशों का पालन किट के साथ एक nucleic एसिड निष्कर्षण प्रदर्शन. इस किट एक स्वचालित प्लेटफार्म (जैसे Qiacube, Qiagen रूप) के उपयोग में सक्षम बनाता है.
3. मानव adenoviruses (HAdV), जे.सी. polyomaviruses (JCPyV), सुअर का adenoviruses (PAdV) और गोजातीय polyomaviruses की मात्रात्मक पीसीआर (BPyV)
- जीनोम की प्रतियां के नमूनों में मात्रा का ठहराव
- तैयार करनाTaqMan पर्यावरण पीसीआर मास्टर मिक्स 2x (एप्लाइड Biosystems) का उपयोग करके एक साफ अलग क्षेत्र में qPCR मिश्रण. प्रतिक्रिया एक 96 में अच्छी तरह से ऑप्टिकल प्रतिक्रिया ऑप्टिकल चिपकने कवर के साथ कवर प्लेट में जगह लेता है. मास्टर मिक्स की सांद्रता, प्राइमरों और जांच तालिका 1 में वर्णित हैं.
- एक बार मिश्रण तैयार किया गया है, अच्छी तरह से नियंत्रण सहित (3.2 देखें) प्रत्येक में विभाज्य 15μl. लक्ष्य के अलावा एक के बाद एक प्रतिक्रिया के लिए कुल मात्रा 25μl (15μl मिश्रण + 10μl नमूना या मानक).
- एक अलग क्षेत्र में नमूने (10μl) से न्यूक्लिक एसिड extractions जोड़ें. दो प्रतियों में प्रत्येक नमूने के पानी को शुद्ध करने में प्रत्यक्ष और एक दस गुना कमजोर पड़ने चलाएँ. एक चिपकने वाला कवर का हिस्सा के साथ नमूने युक्त कुओं को कवर करने के लिए, अगले कदम के लिए कवर के अन्य भाग रखना.
- तीनप्रतियाँ द्वारा 10 0 10 6 GC/10μl से डीएनए मानक निलंबन (10μl) के dilutions जोड़ें और एक विशेष रूप से स्टेन के लिए इस्तेमाल किया micropipette का उपयोगदर्द डीएनए. यह एक प्लास्मिड डीएनए को नष्ट करने और प्रत्येक उपयोग के बाद micropipette साफ करने के लिए पराबैंगनी विकिरण के साथ सुसज्जित क्षेत्र में मानकों को जोड़ने की सलाह दी जाती है. पूर्व में कटौती चिपकने वाला कवर के साथ मानकों से युक्त कुओं कवर.
नोट: के लिए मानक जीनोम प्रतियों की मात्रा का ठहराव में इस्तेमाल किया जा निलंबन तैयार, लक्ष्य डीएनए एक प्लाज्मिड और linearized क्षेत्र में क्लोन किया जाना चाहिए. निम्नलिखित पते में आप कैसे प्लास्मिड डीएनए qPCR में इस्तेमाल किया जा टेम्पलेट्स के साथ मानक घटता बनाने के लिए पर एक विस्तृत प्रक्रिया मिल जाएगा:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - पर्याप्त उचित पैरामीटर (चिपकने वाला कवर और प्रत्येक अच्छी तरह से, आदि में कुल मात्रा का उपयोग पर विचार) का चयन प्रणाली में qPCR प्रदर्शन करना. 95 में 10 मिनट के लिए AmpliTaq गोल्ड के सक्रियण के बाद डिग्री सेल्सियस, प्रवर्धन के 40 चक्रों के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं: 95 ° C पर 15 एसऔर HAdV JCPyV, और BPyV, और 95 पर 15 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट डिग्री सेल्सियस, 55 में 20 डिग्री सेल्सियस और 60 पर 20 PAdV के लिए डिग्री सेल्सियस.
- एक बार प्रतिक्रियाओं पूरा कर रहे हैं, दुकान डेटा और परिणाम के रूप में उपकरण के उपयोगकर्ता पुस्तिका में वर्णित किया. डीएनए की मात्रा कमजोर पड़ने कारक जब जरूरत को सही करने के बाद प्राप्त आंकड़ों की माध्यिका के रूप में परिभाषित किया जाएगा.
- नियंत्रण
- सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का प्रयोग करें. परख एक से अधिक गैर टेम्पलेट (एनटीसी) को नियंत्रित करने के लिए साबित मिश्रण प्रतिदीप्ति उत्पादन नहीं करता है को शामिल करना चाहिए. यह सलाह दी जाती है सकारात्मक प्रक्रिया नियंत्रण चलाने के क्रम में संभावित एंजाइमी अध्ययन नमूनों में मौजूद inhibitors के लिए कारण निषेध का मूल्यांकन.
- मानक और प्रक्रिया नियंत्रण से डीएनए के दो अलग अलग dilutions की qPCR assays के रिकॉर्ड का परिणाम है. परिणामों का उपयोग करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण (QC) assays की संवेदनशीलता और दक्षता के लिए संबंधित कार्यक्रमों के लिए नियंत्रण चार्ट तैयार है.
- की पुष्टिपरिणाम
- सकारात्मक परिणाम आगे amplicons के नेस्टेड-पीसीआर और nucleotide के अनुक्रमण का उपयोग कर, उपभेदों के nucleotide दृश्यों पर अतिरिक्त डेटा के उत्पादन 1,5,6,7,9,12 पता लगाया है की पुष्टि हो सकता है.
प्रक्रिया में वर्णित के बाद, मानव और पशुओं के वायरस पाया गया है और स्नान जल, समुद्री जल और नदी के पानी 2,3 में मात्रा . एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, भूमि नाइट्रेट के उच्च स्तर पेश क्षेत्रों से पानी के नमूने संदूषण के स्रोतों को परिभाषित करने के लिए मूल्यांकन किया गया. दस लीटर पानी के नमूनों स्पेन में पूर्वोत्तर क्षेत्र के ग्रामीण क्षेत्रों में 4 अलग कुओं से एकत्र किए गए थे. पांच प्रतिकृति प्रत्येक अच्छी तरह से किया जा रहा है एक मानव adenovirus 2 प्रक्रिया नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया के साथ वरीयता प्राप्त को दोहराने के में एकत्र थे. चित्र 1 में प्रतिनिधित्व प्रोटोकॉल अनुसार नमूने प्रोसेस किया गया. चार replicates एक चार अध्ययन साइटों की में विश्लेषण PAdV के लिए सकारात्मक परिणाम दिखाया (7.7 मूल्य मतलब4x10 2 जीसी / एल) जो नमूना साइट के आसपास के क्षेत्रों में सुअर slurries की उपस्थिति से संबंधित होगा और भूजल में नाइट्रेट (तालिका 2) के स्रोत के रूप में fecal सुअर का संदूषण का समर्थन करेगी.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 पानी में वायरस का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए प्रक्रिया.
प्राइमरों और qPCR assays के लिए जांच की तालिका 1. एकाग्रता.
टेबल 2 डिटेक्शन और जानवर और भूजल के नमूनों में मानव adenoviruses और polyomaviruses की मात्रा का ठहराव.
n की संख्या का विश्लेषण प्रतिकृति
% प्रतिशत सकारात्मक की प्रतिकृति
(-) गैर का पता चला
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Discussion
प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, विश्वसनीय, सरल, और लागत प्रभावी: वर्णित प्रक्रिया दिनचर्या पर्यावरण और सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं के लिए एक उपयुक्त विधि के लिए शर्तों को पूरा होगा. प्रोटोकॉल सरल है, लेकिन यह सावधानी से पालन किया जाना चाहिए. कृत्रिम समुद्री जल लवण का अनुरोध एकाग्रता को जोड़ने के बिना नमूने में कम चालकता नाटकीय रूप से वायरस की वसूली कम जैसा भी मामला हो अगर flocculation के लिए सरगर्मी समय काफी कम है (उदाहरण के लिए कम से कम 5 घंटे) होगा.
वर्तमान में लागू MST उपकरण आम तौर पर आणविक तकनीक पर आधारित हैं. विभिन्न समूहों द्वारा विकसित अध्ययनों से पता चला है कि वर्तमान में इस्तेमाल किया मानकों के बाहर कोई भी (यानी जीवाणु जीन) के रूप में विशिष्ट है के रूप में की जरूरत है. इस प्रकार इन मानकों का एक संयोजन का उपयोग पानी 8,11 निकायों में fecal संदूषण के मूल के एक कुशल ट्रैकिंग के लिए सबसे अच्छा सन्निकटन के रूप में सुझाव दिया गया है.
jove_content "> हाल के वर्षों में, चयनित डीएनए वायरस है कि कई मामलों में नैदानिक लक्षण के अभाव में लगातार संक्रमण के अध्ययन के स्रोत - ट्रैकिंग वातावरण में fecal संदूषण के लिए एक विधि के रूप में उभरा है मात्रात्मक पीसीआर तकनीक और एकाग्रता प्रस्तावित विधि. इन वायरस की एकाग्रता और जोखिम आकलन अध्ययन और remediation कार्यों के विकास के लिए बहुत मूल्यवान डेटा के विश्वसनीय मान प्रदान इन तकनीकों में भी अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट हैं, जो संदूषण के स्रोत पर नज़र रखने के लिए एक परम आवश्यकता है.. इसके अलावा, वे जाएगा उत्सर्जन और विभिन्न भौगोलिक क्षेत्रों में विशिष्ट माइक्रोबियल स्रोत ट्रैकिंग उपकरण के रूप में प्रस्तावित वायरस के प्रसार के मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए बड़ा डाटा बेस की पीढ़ी के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हो.वर्णित प्रक्रिया कई नमूने के विश्लेषण के साथ के बारे में 48 घंटे में श्रम गहन आवश्यकता के बिना अनुमति देता हैएस एक कुशल एकाग्रता कम लागत वाली विधि की उपलब्धता मात्रात्मक माइक्रोबियल स्रोत ट्रैकिंग अध्ययन और भूजल में contaminants के मूल की पहचान के लिए लागत प्रभावी assays के रूप में पानी में HAdV और JCPyV और PAdV और BPyV के लागू समर्थन करते हैं.
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Disclosures
दो पेटेंट आवेदनों 2009 में दायर किया गया PAdV और BPyV की मात्रा का ठहराव के लिए प्रोटोकॉल के बौद्धिक संपदा की रक्षा के लिए.
Acknowledgments
इस काम आंशिक रूप से स्पेनिश सरकार "Ministerio डे Educación y Ciencia" (परियोजना AGL2008-05275-C01/ALI) द्वारा समर्थित किया गया था, यूरोपीय संघ अनुसंधान 7 फ्रेमवर्क वित्त पोषित परियोजनाओं VIROBATHE (अनुबंध सं 513648), (VIROCLIME अनुबंध सं 243923, ) और पानी के कातालान एजेंसी, AGENCIA Catalana de l'(एसीए) Aigua, Departament डे नियंत्रण मैं Millora dels Ecosistemes तैराकी द्वारा. विकसित अध्ययन के दौरान मार्ता Rusiñol कातालान सरकार "AGAUR" (FI DGR से) के एक साथी था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
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