Summary
Lo studio descrive un metodo conveniente per l'identificazione della fonte di contaminazione fecale / urina o la contaminazione da nitrati in acqua utilizzando qPCR per la quantificazione specifica di virus DNA umano / suini / bovini, adenovirus e poliomavirus, proposti come strumenti di MST.
Abstract
La contaminazione microbica dell'ambiente rappresenta un rischio significativo per la salute. Classica indicatori batterici fecali hanno dimostrato di avere notevoli limitazioni, i virus sono più resistenti ai processi di inattivazione molti indicatori e standard fecale non informare sulla fonte di contaminazione. Lo sviluppo di metodi economici per la concentrazione di virus da acqua e saggi molecolari facilita l'applicabilità di virus come indicatori di contaminazione fecale e come fonte microbica tracking (MST) strumenti. Adenovirus e poliomavirus sono virus a DNA infettare specie di vertebrati specifici compresi gli esseri umani e sono costantemente escreto nelle feci e / o urine in tutte le aree geografiche studiate. In studi precedenti, abbiamo suggerito la quantificazione di adenovirus umani (HAdV) e poliomavirus JC (JCPyV) mediante PCR quantitativa (qPCR) come indice di contaminazione fecale umana. Recentemente, abbiamo sviluppato saggi qPCR per la quantificazione specifica di poradenovirus cine (PAdV) e poliomavirus bovina (BPyV) come animali indicatori di contaminazione fecale con sensibilità di copie del genoma 1-10 per provetta. In questo studio, presentiamo la procedura da seguire per identificare la fonte di contaminazione nei campioni di acqua di questi strumenti. Come esempio dei risultati rappresentativi, l'analisi dei virus nelle acque sotterranee presenta alti livelli di nitrati è mostrato.
Individuazione di virus in acque inquinate o moderatamente bassa richiede la concentrazione del virus da almeno diversi litri di acqua in un volume molto più piccolo, una procedura che di solito comprende due fasi concentrazione in serie. Questa procedura alquanto complesso e la variabilità osservata in recuperi virale ostacolare in modo significativo l'elaborazione simultanea di un gran numero di campioni di acqua.
Al fine di eliminare il collo di bottiglia causato dai due procedure dettagliate abbiamo applicato un passo protocollo sviluppato in Studie precedentes ed applicabile ad una varietà di matrici acqua. La procedura prevede: l'acidificazione di dieci litri di campioni di acqua, flocculazione da latte scremato, sedimentazione dei materiali flocculato, la raccolta del precipitato e centrifugazione, risospensione del precipitato in 10 ml di tampone fosfato. Il concentrato virale è utilizzato per l'estrazione di acidi nucleici virali e l'adenovirus specifico e poliomavirus di interesse sono quantificati da qPCR. Elevato numero di campioni può essere contemporaneamente analizzate con questo metodo a basso costo concentrazione.
La procedura è stata applicata per l'analisi delle acque di balneazione, l'acqua di mare e di acqua di fiume e in questo studio, presentiamo i risultati analizzando campioni di acque sotterranee. Questo high-throughput metodo quantitativo è affidabile, semplice e conveniente.
Protocol
1. Concentrazione delle particelle virali presenti nei campioni di acqua
- Raccolta e condizionamento dei campioni di acqua
- Raccogliere un minimo di 2 repliche di 10 litri per campione in contenitori di plastica con fondo piatto e un campione in più come un controllo di processo. Questo ultimo esempio sarà arricchito con una quantità nota di particelle virali e utilizzato come controllo.
Nota: Si raccomanda di avere particolari materiali utilizzati (bottiglie, tubi, ecc) per i campioni a spillo. - Controllare la taratura del conduttimetro e ricalibrare se necessario. Preparare un controllo negativo utilizzando l'acqua del rubinetto in precedenza regolato la conducibilità adeguato (vedi sotto 1.6) in un ulteriore contenitore in plastica 10 L.
- Per i campioni a spillo: Aggiungere il volume standard del virus di controllo (circa 10 5 copie del genoma per 10 L di acqua) al campione. Mescolare agitando evitando schizzi e aerosol. I controlli positivi potrebbe consistere in un raro ceppo di adenovirus such come HAdV-35 o un batteriofago come MS2.
- Se il campione presenta elevate quantità di materiale in sospensione (sabbia o altri materiali), si lascia sedimentare per 15 minuti. Trasferire l'acqua in un contenitore nuovo.
- Regolare il pH del campione di acqua di 3,5 (± 0,1) con l'aggiunta di 1 N HCl. Questo passaggio è importante per la concentrazione del virus, in modo da assicurarsi che il pH è stato regolato correttamente. Mescolare accuratamente l'acqua agitando vigorosamente, mentre l'aggiunta del HCl. (Nota: se il pH è inferiore a 3,5 aggiungere 1 M di NaOH).
- Regolare la conduttività. Se il campione ha una conducibilità di 1500 mS / cm o superiore, questo passaggio non è necessario. Se la conducibilità è inferiore a 1500 mS / cm la formazione di materiale flocculato (fiocchi) non è garantita in modo regolare la conducibilità a 1500 mS / cm con l'aggiunta di sali marini artificiali (Sigma). Mescolare agitando vigorosamente, mentre l'aggiunta del sale marino.
- Registra il pH dei campioni prima e dopo il condizionamento anche unas il volume di HCl utilizzato. La conducibilità dovrebbero anch'essi essere registrati dopo la regolazione del pH. Disinfettare sempre il pH-metro e conduttimetro elettrodi con una soluzione fresca HCl, dechlorinate con una soluzione di sodio al 10% tiosulphate ed infine risciacquare con acqua distillata.
- Raccogliere un minimo di 2 repliche di 10 litri per campione in contenitori di plastica con fondo piatto e un campione in più come un controllo di processo. Questo ultimo esempio sarà arricchito con una quantità nota di particelle virali e utilizzato come controllo.
- Preparazione di pre-flocculato 1% di latte scremato (PSM)
- Controllare la taratura del pH-metro e conduttimetro e ricalibrare se necessario.
- Preparare pre-flocculato soluzione latte scremato (1 PSM%, w / v), sciogliendo 10 g di latte scremato in polvere (Difco) in 1 L di acqua di mare artificiale (sciogliere 33,3 g di sale marino artificiale in 1 L di acqua del rubinetto declorurata e autoclave) e con attenzione la regolazione del pH a 3,5 con HCl 1N. I fiocchi dovrebbe essere visibile. Preparare la soluzione poco prima da utilizzare o conservare a 4 ° C per 24 h. Per declorazione usare 1 ml di soluzione di tiosulphate 10% per ogni 100 ml di acqua.
- Flocculazione di particelle virali presenti nei campioni di acqua
- Aggiungere 100 ml di 1% PSM al 10-L campione di acqua.
- Mescolare i campioni per 8-10 ore per permettere al virus di adsorbire le fiocchi. Utilizzare un timer per lo spegnimento l'agitazione dopo 8-10 ore
- Fermare l'agitazione e lasciare il sedimento fiocchi per gravità per 8-10 h.
- Raccolta e ri-sciogliendo i fiocchi. Centrifugazione
- Rimuovere il surnatante utilizzando una pompa peristaltica e una pipetta di plastica collegato ad un tubo di plastica. Per i campioni addizionati il surnatante devono essere raccolti in una bottiglia e disinfettati secondo le procedure interne. In tutti i casi ATTENZIONE a non riscuotere il pellet.
- Raccogliere il sedimento con i fiocchi (circa 500 ml) in una bottiglia di centrifuga.
- Equilibrio i piatti con l'aggiunta di pH PSM 3.5.
- Centrifugare i vasi in una centrifuga ad alta velocità a 8.000 xg per 30 min a 4 ° C. Non appena la centrifuga si ferma, rimuovere con cura i vasi centrifuga dalla centrifuga.
- Molto gdipendentemente versare fuori e scartare il surnatante. Seguire le misure appropriate per materiale infetto.
- Aggiungere 7 ml di tampone fosfato a sciogliere il precipitato in ogni bottiglia centrifuga.
- Una volta che i fiocchi sono stati sciolti, misura e aggiungere tampone fosfato a raggiungere un volume totale di 10 ml.
- Omogeneizzare la concentrazione virale vortex e distribuire i 10 ml in microtubi pulite che devono essere congelati a -80 ° C fino al momento in ulteriori analisi.
2. Estrazione acido nucleico
- Effettuare una estrazione degli acidi nucleici con il QIAamp Viral RNA Mini Kit seguenti istruzioni del produttore. Questo kit consente l'utilizzo di una piattaforma automatizzata (come Qiacube, Qiagen).
3. PCR quantitativa di adenovirus umani (HAdV), poliomavirus JC (JCPyV), adenovirus suina (PAdV) e poliomavirus bovina (BPyV)
- Quantificazione delle copie del genoma nei campioni
- Preparareil mix qPCR in una zona pulita separata utilizzando TaqMan Ambientale 2x PCR Master Mix (Applied Biosystems). La reazione avviene in una piastra di reazione 96-ottico ben coperti con coperture adesive ottica. Le concentrazioni del Master Mix, primer e le sonde sono descritte nella tabella 1.
- Quando l'impasto è stato preparato, 15μl aliquota in ciascun pozzetto inclusi i controlli (vedi 3.2). Il volume totale per una reazione dopo l'aggiunta dei target sarà 25μl (mix 15μl campione + 10μl o standard).
- Aggiungere le estrazioni acidi nucleici dai campioni (10μl) in una zona separata. Eseguire diretta e diluizione decimale in acqua purificata di ogni campione in duplicato. Coprire i pozzetti contenenti i campioni con una parte di una cover adesiva, mantenere l'altra parte della copertura per il passo successivo.
- Aggiungi diluizioni di sospensioni standard del DNA (10μl) da 10 0 a 10 6 GC/10μl dal triplice copia e l'utilizzo di una micropipetta utilizzati esclusivamente per le norme sianostandard del DNA. Si consiglia di aggiungere gli standard in una zona attrezzata con radiazioni UV per distruggere il DNA plasmidico e per pulire la micropipetta dopo ogni utilizzo. Coprire i pozzetti contenenti gli standard con il pre-taglio copertina adesiva.
Nota: Per preparare sospensioni standard da utilizzare nella quantificazione delle copie del genoma, la regione di DNA target dovrebbe essere clonato in un plasmide e linearizzato. Nella seguente indirizzo troverete una procedura dettagliata su come creare curve standard con i modelli di DNA plasmidico da utilizzare in qPCR:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - Eseguire la qPCR in un adeguato sistema selezionando i parametri appropriati (considerando l'uso di copertura adesiva e il volume totale in ogni pozzetto, ecc.) Dopo l'attivazione del AmpliTaq Gold per 10 min a 95 ° C, 40 cicli di amplificazione sono effettuate come segue: 15 s a 95 ° Ce 1 min a 60 ° C per HAdV, JCPyV e BPyV, e 15 s a 95 ° C, 20s a 55 ° C e 20s a 60 ° C per PAdV.
- Una volta che le reazioni sono completate, memorizzare i dati ed i risultati come descritto nel manuale d'uso delle apparecchiature utilizzate. La quantità di DNA verrà definito come la media dei dati ottenuti dopo la correzione del fattore di diluizione in caso di necessità.
- Controlli
- Utilizzare i controlli positivi e negativi. Il dosaggio deve includere più di un non-modello di controllo (NTC) per dimostrare mix non produce fluorescenza. Si consiglia di eseguire il controllo positivo di processo al fine di valutare il potenziale inibizione enzimatica a causa di inibitori presenti nei campioni studiati.
- Risultato record di saggi qPCR di due diverse diluizioni del DNA standard e dal controllo di processo. Utilizzare i risultati per preparare carte di controllo per il controllo qualità (QC) i programmi relativi alla sensibilità e l'efficienza del test.
- Conferma dellarisultati
- Risultati positivi possono essere ulteriormente confermata mediante sequenziamento nested-PCR e nucleotidi degli amplificati, producendo ulteriori dati sulle sequenze nucleotidiche dei ceppi individuati 1,5,6,7,9,12.
Seguendo la procedura descritta, i virus umani e animali sono stati individuati e quantificati in acque di balneazione, l'acqua di mare e di acqua di fiume 2,3. Come un esempio rappresentativo, campioni di terra di acqua dai locali che presentano alti livelli di nitrati sono stati valutati per definire le fonti di contaminazione. Dieci litri sono stati raccolti campioni di acqua da 4 pozzi diverse nelle zone rurali di una regione nord-est della Spagna. Cinque replica sono stati raccolti in ciascun pozzetto essere uno replicare seminato con adenovirus umano 2 utilizzati come controllo di processo. I campioni sono stati trattati secondo il protocollo rappresentato nella Figura 1. Le quattro repliche analizzati in uno dei quattro siti studiati hanno mostrato risultati positivi per PAdV (valore medio 7,74x10 2 GC / L) che sarebbe legato alla presenza di fanghi di maiale nelle zone circostanti il sito di campionamento e sosterrebbe la contaminazione fecale suina come fonte di nitrati nelle acque sotterranee (Tabella 2).
4. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Procedura per l'individuazione e la quantificazione dei virus in acqua.
Tabella 1. Concentrazioni dei primer e sonde per saggi qPCR.
Tabella 2. Rilevazione e quantificazione di adenovirus animale e umana e poliomavirus in campioni di acque sotterranee.
n numero di repliche analizzato
% Percentuale di positivi replica
(-) Non rilevati
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Discussion
La procedura descritta potrebbe soddisfare le condizioni per un metodo adatto per routine laboratori ambientali e sanitarie: riproducibile, affidabile, semplice e conveniente. Il protocollo è semplice, ma che devono essere seguite attentamente. Bassa conducibilità nei campioni senza aggiungere la concentrazione richiesta di sali di acqua di mare artificiale ridurrebbe drasticamente il recupero di virus come sarebbe il caso se il tempo di agitazione per la flocculazione è significativamente ridotto (meno di 5 ore per esempio).
Attualmente applicati strumenti MST sono generalmente basate su tecniche molecolari. Gli studi sviluppati da diversi gruppi hanno mostrato che dei parametri attualmente in uso (cioè geni batterici), nessuno è più specifico, se necessario. Così l'uso di una combinazione di questi parametri è stata suggerita come la migliore approssimazione per un monitoraggio efficiente l'origine della contaminazione fecale nei corpi idrici 8,11.
jove_content "> Negli ultimi anni, lo studio dei virus a DNA selezionati che producono in molti casi le infezioni persistenti in assenza di sintomi clinici, è emerso come un metodo per il monitoraggio sorgente di contaminazione fecale dell'ambiente. quantitativa tecniche di PCR e il metodo di concentrazione fornire valori attendibili della concentrazione di questi virus e dei dati molto preziosi per lo sviluppo di studi di valutazione dei rischi e delle azioni di bonifica. Queste tecniche sono anche molto sensibili e specifici, che è un requisito assoluto per il tracciamento della fonte di contaminazione. Inoltre, saranno essere uno strumento molto utile per la generazione di basi di dati più grandi per la caratterizzazione quantitativa dei escrezione e la diffusione del virus specifici proposti come fonte microbica-tracking tool in diverse aree geografiche.La procedura descritta consente l'analisi di campioni contemporaneamente in circa 48 ore senza necessità di manodoperas. La disponibilità di un efficiente metodo a basso costo concentrazione sostenere l'applicabilità della HAdV e JCPyV e PAdV e BPyV in acqua come costo-efficacia analisi quantitative per microbica fonte-tracking studi e identificazione dell'origine di contaminanti nelle acque sotterranee.
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Disclosures
Due domande di brevetto sono state depositate nel 2009 per proteggere la proprietà intellettuale dei protocolli per la quantificazione della PAdV e BPyV.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal governo spagnolo "Ministerio de Educación y Ciencia" (progetto AGL2008-05275-C01/ALI), dall'Unione Europea Quadro di Ricerca 7 progetti finanziati VIROBATHE (contratto n ° 513648), VIROCLIME (contratto n ° 243923 ) e dall'Agenzia catalana di acqua, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de controllo i Millora dels Ecosistemes Aquatics. Durante lo studio ha sviluppato Marta Rusiñol era un collega del governo catalano "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
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