Summary
Studien beskriver en kostnadseffektiv metode for identifisering av kilden til fekal / urin forurensning eller forurensning av nitrater i vann med qPCR for de spesifikke kvantifisering av menneskelig / svin / storfe DNA virus, adenoviruses og polyomaviruses, foreslått som MST verktøy.
Abstract
Mikrobiell forurensning av miljøet representerer en betydelig helserisiko. Har klassisk bakteriell fecal indikatorer vist seg å ha betydelige begrensninger, virus er mer resistente mot mange inaktivering prosesser og standard fecal indikatorene ikke informere om kilden til forurensning. Utvikling av kostnadseffektive metoder for konsentrasjonen av virus fra vann og molekylære analyser forenkler anvendelsen av virus som indikatorer på fekal forurensning og som mikrobiell kilde tracking (MST) verktøy. Adenoviruses og polyomaviruses er DNA virus infiserer spesifikke arter virveldyr, inkludert mennesker, og er vedvarende skilles ut i avføring og / eller urin i alle geografiske områder studert. I tidligere studier, foreslo vi kvantifisering av menneskelig adenoviruses (HAdV) og JC polyomaviruses (JCPyV) av kvantitativ PCR (qPCR) som en indeks for menneskelig fekal forurensning. Nylig har vi utviklet qPCR analyser for de spesifikke kvantifisering av porcine adenoviruses (PAdV) og storfe polyomaviruses (BPyV) som dyr fecal markører for forurensing med følsomheter fra 1-10 genom eksemplarer per reagensrør. I denne studien presenterer vi prosedyren som skal følges for å identifisere kilden til forurensning i vannprøver ved hjelp av disse verktøyene. Som eksempel på representative resultater, er analyse av virus i grunnvann presentere høye nivåer av nitrater vist.
Påvisning av virus i lav eller moderat forurenset vann krever konsentrasjon av virus fra minst flere liter vann i et mye mindre volum, en prosedyre som vanligvis inkluderer to konsentrasjon trinn i serien. Denne noe tungvinte prosedyren og variasjonen hos viral inngang betydelig hinder for samtidig behandling av et stort antall vannprøver.
For å fjerne flaskehalsen forårsaket av to-trinns prosedyrer vi har brukt en ett-trinns protokoll utviklet i tidligere studies og gjelder for et mangfold av vann matriser. Prosedyren omfatter: forsuring av ti-liters vannprøver, flokkulering av skummet melk, gravitasjon sedimentering av flocculated materialer, samling av bunnfall og sentrifugering, resuspendering av bunnfall i 10 ml fosfat buffer. Den viral konsentrere brukes til utvinning av virale nukleinsyrer og de spesifikke adenoviruses og polyomaviruses av interesse er kvantifisert av qPCR. Høyt antall prøver kan samtidig analyseres ved hjelp av denne lavkost konsentrasjon metoden.
Prosedyren har blitt brukt til analyse av badevann, sjøvann og elvevann og i denne studien presenterer vi resultatene analysere grunnvann prøver. Denne high-throughput kvantitative metoden er pålitelig, enkel og kostnadseffektiv.
Protocol
1. Konsentrasjon av viruspartikler til stede i vannprøver
- Innsamling og condition av vannprøver
- Samle minimum 2 replikater av 10 L per prøve i plastbeholdere med flat bunn og en ekstra prøve som en prosess kontroll. Denne siste prøven vil bli tilsatt en kjent mengde viruspartikler og brukes som en kontroll.
Merk: Det anbefales å ha spesielle separate materiale (flasker, rør, etc.) for piggete prøver. - Sjekk kalibreringen av conductimeter og kalibrere om nødvendig. Forbered en negativ kontroll ved hjelp av vann fra springen tidligere tilpasset seg tilstrekkelig ledningsevne (se nedenfor 1.6) i en ekstra plast 10 L container.
- For spiked prøver: Legg standarden volumet av kontroll viruset (ca. 10 5 genomet eksemplarer per 10 liter vann) til prøven. Bland ved å røre unngå sprut og aerosoler. Positive kontroller kan bestå i en uvanlig belastning av adenovirus erUCH som HAdV-35 eller en bakteriofag som MS2.
- Dersom prøven viser stor mengde suspendert materiale (sand eller annet materiale), la det sediment i 15 minutter. Overfør vannet inn i en ny beholder.
- Juster pH i vannprøven til 3,5 (± 0,1) ved tilsetning av 1 N HCl. Dette trinnet er viktig for konsentrasjonen av virus, så pass på at pH er riktig justert. Bland vann grundig ved kraftig omrøring mens legge HCl. (Merk: Hvis pH er lavere enn 3,5 tilsett 1 M NaOH).
- Juster ledningsevne. Dersom prøven har en ledningsevne på 1500 μS / cm eller høyere, er dette trinnet ikke nødvendig. Hvis ledningsevne er lavere enn 1500 μS / cm dannelsen av flocculated materiale (flocs) er ikke garantert så justere ledningsevnen til 1500 μS / cm ved tilsetning av kunstig sjø salter (Sigma). Bland kraftig ved å røre mens du legger havet salter.
- Record pH i prøvene før og etter condition samt ener volumet av HCl brukt. Ledningsevnen bør også registreres etter justering av pH. Alltid desinfisere pH-meter og conductimeter elektroder med en frisk HCl løsning, dechlorinate med 10% natrium tiosulphate løsning og slutt skyll med destillert vann.
- Samle minimum 2 replikater av 10 L per prøve i plastbeholdere med flat bunn og en ekstra prøve som en prosess kontroll. Denne siste prøven vil bli tilsatt en kjent mengde viruspartikler og brukes som en kontroll.
- Utarbeidelse av pre-flocculated 1% skummet melk (PSM)
- Sjekk kalibrering av pH-meter og conductimeter og kalibrere om nødvendig.
- Forbered pre-flocculated skummet melk løsning (1% PSM, w / v) ved å løse opp 10 g skummet melkepulver (Difco) i 1 L kunstig sjøvann (oppløses 33,3 g kunstig sjø salter i 1 L av dechlorinated tappevann og autoklavering) og forsiktig justering av pH til 3,5 med 1N HCl. Den flocs skal være synlig. Forbered løsningen like før skal brukes eller lagres ved 4 ° C i 24 t. For dechlorination bruke 1 ml av 10% tiosulphate løsning per 100 ml vann.
- Flokkulering av viruspartikler til stede i vannprøver
- Tilsett 100 ml 1% PSM til 10-L vannprøve.
- Rør prøvene for 8-10 h slik at virus å adsorberes til den flocs. Bruk en timer til utkobling av omrøring etter 8-10 h.
- Stopp omrøring og la flocs sediment ved tyngdekraften for 8-10 h.
- Innsamling og re-oppløsning av flocs. Sentrifugering
- Fjern supernatanten ved hjelp av en peristaltiske pumpe og en plast pipette koblet til et plastrør. For spiked prøver supernatanten skal samles i en flaske og desinfiseres i henhold til interne prosedyrer. I alle tilfeller TAKE CARE ikke å hente pellets.
- Samle sediment med flocs (ca 500 ml) i en sentrifuge flaske.
- Balanse pottene med tillegg av PSM pH 3,5.
- Sentrifuger pottene i en high-speed sentrifuger ved 8000 xg i 30 min ved 4 ° C. Så snart sentrifuge stopper, forsiktig fjerne sentrifugen potter fra sentrifugen.
- Veldig gently hell av og kast supernatanten. Følg hensiktsmessige tiltak for smittefarlig materiale.
- Legg til 7 ml av fosfat buffer til å oppløse pelleten i hvert sentrifuge flaske.
- Når flocs har blitt oppløst, måle og legge fosfat buffer for å nå et totalt volum på 10 ml.
- Homogenisere viral konsentrere ved virvling og distribuere 10 ml inn i rene mikrorør som bør fryses ved -80 ° C inntil nødvendig i videre analyse.
2. Nukleinsyre-ekstraksjon
- Utfør en nukleinsyre ekstraksjon med QIAamp Viral RNA Mini Kit følge produsentens instruksjoner. Dette settet muliggjør bruk av en automatisert plattform (som Qiacube, Qiagen).
3. Kvantitativ PCR av menneskelig adenoviruses (HAdV), JC polyomaviruses (JCPyV), svin adenoviruses (PAdV) og storfe polyomaviruses (BPyV)
- Kvantifisering av genomet eksemplarer i prøvene
- Forberedden qPCR mix i et rent eget område ved å bruke TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). Reaksjonen foregår i et 96-godt optisk reaksjon plate dekket med optisk lim dekker. Konsentrasjoner av Master Mix, er primere og prober som er beskrevet i Tabell 1..
- Når blandingen er utarbeidet, alikvoter 15μl i hver brønn inkludert kontrollene (se 3.2). Det totale volumet for en reaksjon etter tilsetning av målet vil bli 25μl (15μl mix + 10μl sample eller standard).
- Legg til nukleinsyre utdrag fra prøvene (10μl) i et eget område. Kjør direkte og en ti-fold fortynning i renset vann for hver prøve i to eksemplarer. Dekk brønnene inneholder prøvene med en del av en selvklebende cover, holde den andre delen av dekselet for følgende trinn.
- Legg fortynninger av DNA standard suspensjoner (10μl) fra 10 0-10 6 GC/10μl ved tre eksemplarer og bruke en mikropipette utelukkende brukes til standard DNA. Det er tilrådelig å legge standarder på et område utstyrt med UV-stråling for å ødelegge plasmid DNA og å rense mikropipette etter hver bruk. Dekk brønnene inneholder standarder med pre-cut lim dekke.
Merk: For å forberede standard suspensjoner som skal brukes i kvantifisering av genomet eksemplarer, bør målet DNA regionen blir klonet inn i et plasmid og lineært. I det følgende adresse finner du en detaljert fremgangsmåte på hvordan å lage standard kurver med plasmid DNA maler som skal brukes i qPCR:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - Utfør qPCR inn et tilstrekkelig system velge de riktige parametrene (vurderer bruk av lim cover og det totale volumet i hver brønn, etc). Etter aktivering av AmpliTaq Gold for 10 min ved 95 ° C, 40 sykluser av forsterkning er utført som følger: 15 s ved 95 ° Cog 1 min ved 60 ° C for HAdV, JCPyV og BPyV, og 15 s ved 95 ° C, 20 ved 55 ° C og 20-årene ved 60 ° C for PAdV.
- Når reaksjoner er ferdig, lagre data og resultater som beskrevet i bruksanvisningen til utstyret som brukes. Mengden DNA vil bli definert som medianen av data innhentet etter korrigering fortynningsfaktoren når det trengs.
- Controls
- Bruk positive og negative kontroller. Analysen må omfatte mer enn en ikke-mal kontroll (NTC) å bevise blande ikke produserer fluorescens. Det er tilrådelig å kjøre positiv prosess kontroll for å vurdere potensielle enzymatisk hemming på grunn hemmere stede i studerte prøvene.
- Rekordresultat fra qPCR analyser av to forskjellige fortynninger av standard DNA og fra prosesskontroll. Bruk resultatene til å forberede kontroll diagrammer for kvalitetskontroll (QC) programmer relatert til følsomheten og effektiviteten i analysene.
- Bekreftelse avresultater
- Positive resultater kan bli ytterligere bekreftet ved hjelp av nestede-PCR og nucleotide sekvensering av amplicons, oppdaget 1,5,6,7,9,12 produsere ytterligere data om nukleotidsekvenser av stammer.
Etter prosedyren som er beskrevet, har mennesker og dyr virus påvist og kvantifisert i badevann, sjøvann og elvevann 2,3. Som et representativt eksempel, ble bakken vannprøver fra områder presentere høye nivåer av nitrater evaluert for å definere kildene til forurensning. Ten-liters vannprøver ble samlet inn fra fire forskjellige brønner på landsbygda av en Nordøst-regionen i Spania. Fem replikeres ble samlet inn i hver brønn være en replikere seeded med menneskelige adenovirus 2 brukes som prosesskontroll. Prøvene ble behandlet i henhold til protokollen representert i figur 1. De fire replikeres analysert i en av de fire områdene studerte viste positive resultater for PAdV (gjennomsnittlig verdi 7,74x10 to GC / L) som ville være knyttet til tilstedeværelsen av gris slam i områdene rundt prøvetaking området og ville støtte fecal svin forurensning som kilde til nitrat i grunnvann (tabell 2).
Fire. Representant Resultater:
Figur 1. Prosedyre for påvisning og kvantifisering av virus i vann.
Tabell 1. Konsentrasjon av primere og prober for qPCR analyser.
Tabell 2. Deteksjon og kvantifisering av dyr og menneskelige adenoviruses og polyomaviruses i bakken vannprøver.
n antall gjentak analyserte
% Andel av positive gjentak
(-) Ikke detektert
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosedyren er beskrevet ville oppfylle vilkårene for en passende metode for rutinemessig miljø og folkehelse laboratorier: reproduserbar, pålitelig, enkel og kostnadseffektiv. Protokollen er enkel, men den må følges nøye. Lav ledningsevne i prøvene uten å legge den ønskede konsentrasjon av kunstig sjøvann salter vil dramatisk redusere utvinning av virus som ville være tilfelle dersom omrøring tid for flokkulering er betydelig redusert (mindre enn 5 timer for eksempel).
Foreløpig anvendes MST verktøy er generelt basert på molekylære teknikker. Studier utviklet av ulike grupper har vist at ut av tiden brukes parametrene (dvs. bakterielle gener) ingen er så spesifikk som nødvendig. Dermed bruk av en kombinasjon av disse parameterne har vært foreslått som den beste tilnærming for en effektiv sporing av opprinnelsen til fekal forurensning i vannforekomster 8,11.
jove_content "> I de senere årene har studiet av utvalgte DNA virus som produserer i mange tilfeller vedvarende infeksjoner i fravær av kliniske symptomer, dukket opp som en metode for kilde-sporing fecal forurensning i miljøet. Kvantitativ PCR teknikker og konsentrasjonen metoden foreslåtte gi pålitelige verdier av konsentrasjonen av disse virusene og svært verdifulle data for utvikling av risiko-vurdering studier og utbedring handlinger. Disse teknikkene er også svært sensitive og spesifikke, som er et absolutt krav for å spore kilden til forurensning. Dessuten vil de være et svært nyttig verktøy for generering av større databaser for kvantitativ karakterisering av utskillelse og formidling av bestemte virus foreslått som mikrobiell kilde-sporing verktøy i ulike geografiske områder.Prosedyren er beskrevet tillater analyse av flere prøver samtidig i ca 48 timer uten intensive arbeid kravs. Tilgjengeligheten av en effektiv lavkost konsentrasjon metode støtte anvendelsen av HAdV og JCPyV, og PAdV og BPyV i vann som kostnadseffektive analyser for kvantitativ mikrobiell kilde-tracking studier og identifisering av opprinnelsen til forurensninger i grunnvannet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
To patentsøknader ble sendt i 2009 for å beskytte åndsverk av protokoller for kvantifisering av PAdV og BPyV.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av den spanske regjeringen "Ministerio de Educación y Ciencia" (prosjekt AGL2008-05275-C01/ALI), av EU forskning Framework 7 finansierte prosjekter VIROBATHE (Kontrakt nr. 513648), VIROCLIME (Contract No 243923 ) og av den katalanske Agency of Water, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de styrer jeg Millora dels Ecosistemes Aquatics. Under utviklet studiet Marta Rusiñol var en kar av den katalanske regjeringen "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
