Summary
Исследование описывает эффективный метод для идентификации источника фекальных / мочи заражения или загрязнения нитратами в воде с помощью КПЦР для конкретного количественного человека / свинины / бычьей ДНК-вирусы, аденовирусы и polyomaviruses, предложил в качестве инструментов MST.
Protocol
1. Концентрация вирусной частицы, присутствующие в пробах воды
- Сбор и кондиционирования проб воды
- Сбор минимум 2 повторов 10 л на один образец в пластиковых контейнерах с плоским дном и один дополнительный образец в качестве управления процессами. Последний пример будет подсыпали известное количество вирусных частиц и используются в качестве контроля.
Примечание: рекомендуется иметь специальный отдельный материал (бутылки, трубы и т.д.) для шипами образцов. - Проверьте калибровку conductimeter и откалибровать, если необходимо. Подготовка отрицательного контроля с использованием водопроводной воды доводят до ранее адекватной проводимости (см. ниже 1.6) в один дополнительный пластиковый контейнер 10 л.
- Для шипами образцов: Добавить стандартного объема контроля вируса (около 10 5 копий генома на 10 л воды) для образца. Смешайте перемешиванием избежать брызг и аэрозолей. Положительные контроля могли бы состоять в необычных штамм аденовируса суч как HAdV-35 или бактериофаги, такие как MS2.
- Если образец представляет высокое количество взвешенных частиц (песка или других материалов), пусть это осадков в течение 15 минут. Передача воды в новый контейнер.
- Отрегулируйте рН пробы воды до 3,5 (± 0,1) путем добавления 1 н HCl. Этот шаг важен для концентрации вирусов, поэтому убедитесь, что рН были должным образом закреплены. Смешайте воду тщательно интенсивном перемешивании с добавлением соляной кислоты. (Примечание: если рН ниже 3,5 добавляют 1 М NaOH).
- Отрегулируйте проводимости. Если образец имеет проводимость 1500 мкСм / см и выше, этот шаг не нужен. Если проводимость ниже, чем в 1500 мкСм / см образование флоккулируют материала (хлопья) не гарантируется так регулировать проводимость до 1500 мкСм / см за счет добавления искусственных морской соли (Sigma). Mix энергично перемешивают, добавляя морскими солями.
- Запись рН образцов до и после кондиционирования, а такжес объемом соляной кислоты используются. Проводимость должна быть записано после корректировки рН. Всегда дезинфекции рН-метр и conductimeter электродов с свежим раствором соляной кислоты, dechlorinate с 10% раствором натрия tiosulphate и, наконец, промыть дистиллированной водой.
- Сбор минимум 2 повторов 10 л на один образец в пластиковых контейнерах с плоским дном и один дополнительный образец в качестве управления процессами. Последний пример будет подсыпали известное количество вирусных частиц и используются в качестве контроля.
- Подготовка предварительного флоккулируют 1% обезжиренное молоко (PSM)
- Проверка калибровки рН-метра и conductimeter и откалибровать, если необходимо.
- Подготовка предварительно флоккулируют обезжиренное молоко решение (1% PSM, в / о), растворив 10 г сухого обезжиренного молока (Difco) в 1 л искусственной морской воде (растворяется 33,3 г искусственной морской соли в 1 л дехлорированию водопроводной воды и автоклав) и Тщательно регулируя рН до 3,5 1н HCl. Хлопья должны быть видны. Подготовка решения непосредственно перед, которые будут использоваться или хранить при температуре 4 ° С в течение 24 ч. Для дехлорирования использовать 1 мл 10% раствора на tiosulphate 100 мл воды.
- Флокуляция вирусные частицы, присутствующие в пробах воды
- Добавить 100 мл 1% PSM к 10-Л пробы воды.
- Движение образцов в течение 8-10 ч, чтобы позволить вирусам адсорбироваться на хлопья. Используйте таймер на отключение помешивая через 8-10 ч.
- Остановите перемешивание и пусть хлопья осадка под действием силы тяжести в течение 8-10 ч.
- Сбор и повторное растворение хлопьев. Центрифугирование
- Удалить супернатант использованием перистальтического насоса и пластиковые пипетки связаны с пластиковой трубкой. Для шипами образцы супернатанта должны быть сложены в бутылку и дезинфекции в соответствии с внутренними процедурами. Во всех случаях старайтесь не собирать гранул.
- Сбор осадка хлопьев (около 500 мл) в центрифуге бутылку.
- Баланс горшки путем добавления ПСМ рН 3,5.
- Центрифуга горшки в высокоскоростной центрифуге при 8000 мкг в течение 30 мин при 4 ° C. Как только центрифуги останавливается, осторожно удалите центрифуги горшки из центрифуги.
- Очень гвидимому слейте и выбросьте супернатант. Следуйте надлежащие меры по инфекционным материалом.
- Добавить 7 мл фосфатного буфера для растворения гранул в каждой центрифуге бутылку.
- Как только хлопья были разведены, измерять и добавлять фосфатный буфер, чтобы достичь общего объема 10 мл.
- Однородный вирусного концентрата на вортексе и распространение 10 мл в чистые микропробирок которых должны быть заморожены при температуре -80 ° C до необходимости в дальнейшем анализе.
2. Выделения нуклеиновых кислот
- Выполните извлечение нуклеиновых кислот с QIAamp Вирусная РНК Mini Kit следующие инструкции производителя. Этот комплект позволяет использовать автоматизированные платформы (например, Qiacube, Qiagen).
3. Количественный ПЦР человека аденовирусы (HAdV), JC polyomaviruses (JCPyV), свиней аденовирусы (ПБНС) и бычьего polyomaviruses (BPyV)
- Количественная оценка геном копиями в образцах
- ГотовитьКПЦР смесь в чистую отдельную область с помощью TaqMan Экологическая ПЦР Master Mix 2x (Applied Biosystems). Реакция происходит в 96-и оптических реакция пластины, покрытой с оптическим охватывает клея. Концентрации Master Mix, праймеры и зонды, описаны в таблице 1.
- Как только смесь была подготовлена, аликвоту 15μl в каждую лунку, включая элементы управления (см. 3.2). Общий объем для одной реакции после добавления цель будет 25 мкл (15μl микс + 10 мкл образца или стандарта).
- Добавить нуклеиновой кислоты выписки из образцов (10 мкл) в отдельную область. Выполнить прямое и десять раз разбавления в очищенной воде каждого образца в двух экземплярах. Обложка скважин содержащих образцы с частью клей крышкой, держать другой части прикрытия для следующего шага.
- Добавить разведения ДНК стандартных суспензий (10 мкл) от 10 0 до 10 6 GC/10μl от трех экземплярах и использовании микропипетки исключительно для стандартастандартные ДНК. Желательно, чтобы добавить стандартов в области оснащены УФ-излучение для разрушения ДНК плазмиды и очистить микропипетки после каждого использования. Обложка скважин содержащих стандарты нарезанные клей крышкой.
Примечание: Для подготовки стандартных суспензий, которые будут использоваться в количественной оценке геном копиями, область ДНК-мишени должны быть клонирован в плазмиду и линеаризованных. В адресу вы найдете подробные процедуры по созданию стандартных кривых плазмидой ДНК шаблоны для использования в КПЦР:
http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf - Выполните КПЦР в адекватной системы выбора соответствующих параметров (с учетом использования клея покрытия и общий объем в каждой лунке, и т.д.). После активации Золотой AmpliTaq течение 10 мин при 95 ° C, 40 циклов амплификации осуществляется следующим образом: 15 с при 95 ° Cи 1 мин при 60 ° С в течение HAdV, JCPyV и BPyV, и 15 с при 95 ° C, 20-е годы при температуре 55 ° С и 20-е годы при температуре 60 ° С в течение ПБНС.
- Как только реакция завершена, хранить данные и результаты, как описано в руководстве пользователя используемого оборудования. Количество ДНК будет определяться как среднее из данных, полученных после исправления коэффициент разбавления, когда это необходимо.
- Управления
- Использование положительного и отрицательного контроля. Анализ должен включать более одного не-шаблон контролем (NTC), чтобы доказать смесь не вызывает флуоресценцию. Желательно, чтобы запустить процесс положительного контроля с целью оценки потенциальных ингибирования ферментов в связи с ингибиторами настоящее время в исследованных образцах.
- Запись результатов анализов КПЦР двух различных разведений стандартной ДНК и от процесса управления. Использование результатов, подготовить контрольные карты для контроля качества (КК), программы, связанные с чувствительностью и эффективность анализа.
- ПодтверждениеРезультаты
- Положительные результаты могут быть дополнительно подтверждена с помощью вложенных ПЦР и нуклеотидной последовательности ампликонов, производя дополнительных данных о нуклеотидных последовательностей штаммов обнаружен 1,5,6,7,9,12.
После процедуры, описанной, человека и животных вирусов были обнаружены и количественно вод для купания, морской и речной воды 2,3. Как типичный пример, молотый проб воды из областей с высокой степенью уровень нитратов были оценены для определения источников загрязнения. Десять-литровые пробы воды были собраны из 4-х различных скважин в сельских районах Северо-Восточного региона в Испании. Пять повторяет были собраны в каждую лунку являясь одним повторить посеяны с человеческим аденовирусом 2 используется в качестве управления процессами. Образцы были обработаны в соответствии с протоколом представлена на рисунке 1. Четыре повторяет проанализированы в одном из четырех участков изучали показал положительные результаты для ПБНС (среднее значение 7,74x10 2 GC / л), который был бы связан с наличием шламов свиней в районах, прилегающих отбора проб и будет поддерживать загрязнения фекалиями свиней в качестве источника нитратов в подземных водах (табл. 2).
4. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Процедура обнаружения и количественного определения вирусов в воде.
Таблица 1. Концентрация праймеры и зонды для КПЦР анализов.
Таблица 2. Обнаружение и количественное определение животных и человека, аденовирусы и polyomaviruses в пробах грунтовых вод.
N количество дубликатов проанализированы
% Процент положительных повторяет
(-) Не обнаружены
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура, описанная выполнит условия для установки методом для рутинной окружающей среды и лаборатории общественного здравоохранения: воспроизводимый, надежный, простой и экономически эффективной. Протокол прост, однако он должен быть тщательно следили. Низкая проводимость в образцах без добавления просил концентрации искусственной морской воде солей бы резко сократить восстановления вирусов как было бы в случае, если помешивая время для флокуляции значительно снижается (менее 5 часов, например).
В настоящее время применяется MST инструменты, как правило, на основе молекулярных методов. Исследования, разработанных разными группами показали, что из используемых в настоящее время параметры (т.е. бактериальных генов) ни одна не настолько специфичны, насколько это необходимо. Таким образом, использование комбинации этих параметров был предложен в качестве наилучшего приближения для эффективного отслеживания происхождения фекальных загрязнений в водоемах 8,11.
jove_content "> В последние годы изучение выбранной вирусы ДНК, которые производят во многих случаях стойких инфекций в отсутствие клинических симптомов, возник как метод отслеживания источников загрязнения фекалиями в окружающую среду. Количественные методы полимеразной цепной реакции и концентрации методом, предложенным обеспечить надежные значения концентрации этих вирусов и очень ценные данные для разработки методов оценки рисков исследования и корректирующие меры. Эти методы также высокую чувствительность и специфичность, которая является обязательным требованием для слежения за источником загрязнения. Кроме того, они будут быть очень полезным инструментом для создания больших баз данных для количественной характеристики выделения и распространения конкретных вирусов предложен в качестве микробного источником средств выявления в различных географических районах.Процедура, описанная позволяет анализировать несколько образцов одновременно в 48 часов без интенсивного требование трудаs. Наличие эффективных недорогих концентрации Поддержка метода применимости HAdV и JCPyV и ПБНС и BPyV в воде, как экономически эффективные тесты для количественного микробного источник отслеживание исследования и идентификации происхождения загрязняющих веществ в грунтовые воды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Две заявки на патенты были поданы в 2009 году для защиты интеллектуальной собственности протоколов для количественной оценки ПБНС и BPyV.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана правительством Испании "Ministerio де Educación у Ciencia» (проект AGL2008-05275-C01/ALI), Европейским Союзом Рамочной исследовательской 7 проектов, финансируемых VIROBATHE (контракт № 513648), VIROCLIME (контракт № 243923 ) и Агентством каталонского Воды, Agencia Catalana де l'Aigua (ACA), Департамент управления де я Millora ДЕЛЬЗ Ecosistemes водных видов спорта. Во время исследования разработан Мартой Rusiñol был членом правительства каталонской "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow Pumps Group | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco Laboratories | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
References
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
